种鸡H5+H7N9二价苗免疫效果的跟踪监测

潘 杰，陈松春，王自强，莫钻兰，黄育浩

（1．东莞市动物疫病预防控制中心,广东 东莞 523086；2．东莞市常平农业技术服务中心,广东 东莞 523086）

2013年3月31日首先在中国上海和安徽发现了3例人感染H7N9流感病例。自2016年以来,H7N9流感病毒发生变异,从对家禽的低致病性变异为对家禽尤其是鸡的高致病性,目前已报道发生H7N9流感疫情较多的是种鸡场。为遏制H7N9流感疫情，2017年7月开始广东率先试用H5+H7N9二价苗。为掌握H5+H7N9二价苗对种鸡的保护效果和抗体水平消涨情况，对东莞市某种鸡场在已有H5亚型禽流感免疫基础上，开展H5+H7N9二价苗免疫试验，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 试验动物

来自东莞市某种鸡场，选取同一批次30羽种鸡为试验动物，已免疫广东永顺生物制药股份有限公司提供的重组禽流感病毒H5亚型三价灭活疫苗（H5N1,Re-6株 +Re-7株+Re-8株，批号：2017010）2次。翅静脉采血，3500r/min离心15min分离获得待检血清，-20℃保存备检。

1.2 试验材料

1.2.1 疫苗 由哈尔滨维科生物技术开发公司提供的重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1 株)，批号为 20180603。

1.2.2 1%鸡红细胞悬液 采集实验室饲养的3只禽流感和新城疫非免疫的健康公鸡的血液与阿氏液等体积混合，用pH值7.2的0.01mol/L PBS液洗涤3次，每次以1000r/min离心10min，洗涤后用PBS液配成体积分数1%鸡红细胞悬液，4℃保存备用。

1.2.3 检测试剂 抗体检测试剂禽流感H5N1 Re-8株和H7N9 H7-Re1株抗原及阳性血清，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。

1.2.4 主要耗材和仪器 96孔“V”型反应板，离心机，8道移液器，微量震荡器。

1.3 方 法

1.3.1 试验步骤 对试验禽在免疫H5-H7N9二价苗前（0d即免疫当天）采集血清样品，检测抗体水平，随后对试验禽按0.5mL/羽进行 H5-H7N9 二价苗一免。一免后 7、14、21、28、75d各采集一次血清样品，而且21d采样后当天按0.5mL/羽进行二次免疫。

1.3.2 检测方法 按照《高致病性禽流感诊断技术》(GB/T18936-2003)规定的血凝与血凝抑制方法操作。以完全抑制4单位抗原的血清最高稀释倍数作为HI的滴度。HI效价小于或等于31og2判阴性，HI效价大于或等于41og2判阳性,判定为抗体合格。

表1 种鸡免疫H5+H7N9二价苗后H5N1 Re-8株抗体效价检测结果

表2 种鸡免疫H5+H7N9二价苗后H7N9 H7-Re1株抗体效价检测结果

2 结果

2.1 H5N1 Re-8株抗体效价检测结果

在已免疫H5亚型基础上，该批鸡只在注射H5+H7N9二价苗前的当天（0d）、一免后 7d、14d、21d（21d 采样后当天内进行二免）、28d（二免后7d），抗体阳性数均为30，抗体保护率均为100.00%，一免后75d（二免后54d），抗体阳性数为26，抗体保护率为86.67%。14d到达峰值，随后逐步下降，在二免后仍呈现下降趋势，整体抗体效价较高，即使在免疫后75d仍能维持较高的效价和100%的保护率。

2.2 H7N9 H7-Re1株抗体效价检测结果

在免疫H5+H7N9二价苗前（0d）采样检测，抗体阳性数为1，抗体保护率为3.45%，一免后7d，阳性数为11，抗体保护率为36.67%，一免后14d，阳性数为26，抗体保护率为89.66%，一免后21d（21d采样后当天内进行二免），阳性数为24，阳性率为85.71%，一免后28d（二免后7d），阳性数为30，抗体保护率为100.00%，一免后75d（二免后54d），阳性数为27，抗体保护率为90.00%。一免后呈现稳步上升趋势，并在21d开始出现回落，二免后继续呈现上升趋势，直至75d。

3 讨论

3.1H7N9流感是一种近年来新报道有人感染的流感，传染源主要是带毒的家禽或家禽感染后通过粪便、唾液和鼻腔分泌物和粪便等排出的病毒，人主要是通过接触染毒家禽或者被其污染的物品或环境引起感染。

3.2从本次试验结果来看，该H5+H7N9二价苗对群体H5N1 Re-8株抗体水平在一免、二免后能一直维持80%以上，H7N9 H7-Re1株抗体水平在一免14d后上升到80%以上，二免后7d达到峰值并能够继续上升，证明对两种毒株均能够起到良好的免疫效果，适用于大规模群体性集中免疫。

3.3对个体H7N9 H7-Re1株抗体水平比较稳定，一免、二免后抗体水平均呈现稳步上升趋势，证明该疫苗在H7N9 H7-Re1株方面具有较高的免疫原性。

3.4相对而言，H5N1 Re-8株抗体水平不稳定，主要是二免后抗体水平出现下降趋势，一般来说，灭活疫苗在二免后应该能够进一步引起免疫应答，抗体水平应该比一免要高，而且一免后抗体水平也属于稳步上升，H7N9 H7-Re1株也未出现类似情况，是否存在免疫抑制仍有待进一步研究。

3.5免疫前（0d）出现1份样品H7N9 H7-Re1株抗体滴度大于4log2，可能与实验过程中出现误差有关。

3.6东莞市目前家禽存栏量约为60万羽，其中规模养殖家禽45万羽，未来在高致病性禽流感免疫方面，将对全部家禽使用H5+H7N9二价苗免疫，对水禽方面以H5N2 D7株为辅助，能够保证存栏家禽对AIV病毒起到充足的抵御力。

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