柚皮苷通过Fas膜受体通路调控髓核细胞凋亡的机制研究*

苑珍珍 ，杨 召 ，金鸿宾 ，许海委

椎间盘退变是引起颈腰部疾患的前提和基础。有统计显示，世界上一半以上的人口会受到颈腰痛的困扰[1]。椎间盘连接上下两个椎体，是维持脊柱结构与功能的重要组成部分。髓核细胞是构成椎间盘的主要成分，可以合成和分泌细胞外基质，在椎间盘退变过程中发挥着重要作用。骨碎补是治疗肾虚腰痛的常用药，具有补肾壮骨，活血止痛的作用。柚皮苷作为其主要组成单体，研究显示其具有抑制髓核细胞退变的作用，但作用机制报道较少[2]。本实验选取Fas/FasL通路，观察柚皮苷对人退变椎间盘髓核细胞凋亡的影响，进一步阐明其可能的机制。

1 材料与方法

1．1 组织来源 人退变椎间盘髓核组织取自1例因椎间盘突出行椎间盘切除手术的患者，年龄50岁。术前取得患者同意，并签署知情同意书。取材时严格无菌操作，取材后1h内细胞室内进行髓核细胞分离培养。

1.2 主要试剂及仪器 DMEM培养基（GIBCO公司，美国），乙二胺乙酸二钠（EDTA）（Sigma公司，美国），胎牛血清（GIBCO公司，美国），甲苯胺蓝溶液（北京东胜泰博科技有限公司，北京）；CO2培养箱（Hera-cell公司，德国），恒温摇床（Heidolph公司，德国），倒置显微镜（OLYMPUS公司，日本），细胞培养板（Corning公司，美国），高通量实时荧光定量聚合酶链锁反应（PCR）仪（Roche公司，瑞士），百级层流细胞室（天津医院细胞工程室）。

1.3 方法

1.3.1 人退变椎间盘髓核细胞的分离和培养 将髓核组织用含青霉素和不含青霉素的D-Hanks液各冲洗3遍；将髓核组织剪碎，37℃下用0.25%的胰蛋白酶和0.2%的Ⅱ型胶原酶联合消化40 min，消化期间一直放置于摇床上，轻轻晃动。收集消化液，1 000 r/min离心5 min，去除上清液。用DMEM/F12培养液吹匀细胞，再次离心，重复3次。用计数板进行细胞计数，按1×106接种于底面积为25 cm2培养瓶中，加入5 mL含青霉素100 U/mL、10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液。37℃、体积分数为5%CO2的培养箱中培养。每3 d换液1次，90%融合后用浓度为0.05%的胰酶消化传代。

1.3.2 髓核细胞的鉴定 番红O染色：P1代细胞多聚甲醛固定后，1%番红O染色后，光镜下观察细胞分泌蛋白多糖能力。

甲苯胺蓝染色：细胞固定后，1%甲苯胺蓝染色10 min，磷酸盐（PBS）缓冲液冲洗，封片，光镜下观察细胞分泌糖胺聚糖能力。

1.3.3 噻唑蓝（MTT）法选择柚皮苷抑制人髓核细胞凋亡的最佳浓度 采用MTT法测定不同浓度柚皮苷（0、20、40、80 μg/mL）对髓核细胞凋亡的抑制作用，髓核细胞加入含柚皮苷的培养基72 h后，用MTT实验检测柚皮苷对髓核细胞的抑制作用，利用酶标仪在720 nm波长处测定吸光度A，筛选柚皮苷抑制髓核细胞凋亡的最佳浓度，定为实验组，0 μg/mL柚皮苷为空白对照组。

1.3.4 流式细胞仪测定细胞凋亡率 培养髓核细胞24 h，胰酶消化、计数、离心、洗涤、弃上清后再离心、重复洗涤细胞1次，加入5 μL膜联蛋白V-FITC混合均匀后，避光孵育15 min后离心洗涤细胞，加入3 μL碘化丙啶混合均匀后，流式细胞仪测定细胞凋亡率。

1.3.5 实时荧光定量PCR检测Fas、FasL、Caspase-8基因表达情况 实验组和对照组P3代髓核细胞培养7 d后，常规消化收集细胞，加入1 mL Trizol试剂，采用相分离技术提取RNA，紫外分光光度法测定其在280 nm和260 nm处的吸光度，计算RNA浓度和纯度（OD260/OD280，正常值为 1．7～2．0）。各组检测基因反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，引物（北京奥科鼎盛生物科技有限公司）如表1。逆转录反应体系、PCR扩增体系以及反应条件，依据说明书设定。反应完成后进行扩增曲线和熔解曲线分析。基因表达量中检测基因的初始模板量以2-△△Ct表示。

1.3.6 蛋白免疫印迹法（Western-blot）检测Fas蛋白 收集髓核细胞，加入RIPA裂解液冰上裂解，细胞裂解后，微孔法测定蛋白浓度，冲洗后加热，使蛋白变性，上样、电泳后转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，室温封闭。加入适当稀释的一抗（Fas 1∶200，FasL 1∶100，Caspase-8 1∶100）,室温下反应1 h。加入相应二抗，漂洗后，用化学发光成像系统记录结果。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20．0统计软件包进行分析，数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，P＜0．05为有统计学意义。

2 结果

2.1 髓核细胞培养以及形态观察 原代髓核细胞7 d后基本贴壁,细胞呈梭形。15 d后，细胞进入对数生长期，见图1。

图1 接种7 d后的细胞Fig.1 Cells inoculated for 7 days(×200)

2.2 髓核细胞的鉴定 番红-O染色和甲苯胺蓝染色均为阳性，表明细胞可以分泌蛋白多糖和糖胺多糖，见图 2、图 3。

图2 髓核细胞番红-O染色(×200)Fig.2 Red-O staining of nucleus pulposus cells(×200)

图3 髓核细胞甲苯胺蓝化学染色(×200)Fig.3 Toluidinebluestainingofnucleuspulposuscells(×200)

表 1 Fas、FasL、Caspase-8、GAPDH 基因引物Tab.1 Fas、FasL、Caspase-8、GAPDH primer

2.3 MTT法检测柚皮苷抑制人髓核细胞凋亡的最佳浓度 对照组吸光度为（0．26±0．02），与对照组相比，20 μg/mL柚皮苷组吸光度明显升高，具有统计学意义（P＜0．01），而 40、80 μg/mL 柚皮苷组无统计学意义（P＞0．05）。与20μg/mL柚皮苷组比较，40、80μg/mL柚皮苷组吸光度明显降低（P＜0．01）。80 μg/mL 柚皮苷组吸光度值无明显差异（P＞0．05)。见表2。

表2 MTT法检测柚皮苷抑制人髓核细胞凋亡（x±s）Tab.2 MTT assay of naringin to inhibit the apoptosis of human nucleus pulposus cells（x±s）

2.4 流式细胞仪测定细胞凋亡率 对照组细胞凋亡率为（12．48±1．38）%，加入不同浓度柚皮苷后，凋亡率均下降，与对照组相比，20、40 μg/mL柚皮苷组抑制细胞凋亡具有统计学意义（P＜0．05），其中20 μg/mL 柚皮苷对细胞凋亡抑制最明显（P＜0．01），与 20 μg/mL 柚皮苷组比较，40、80 μg/mL 柚皮苷组细胞凋亡率较高（P＜0．01）。另外，40 μg/mL 柚皮苷组优于 80 μg/ml柚皮苷组（P＜0．05），见表 3、图 4。根据MTT与流式细胞的筛选结果采用20 μg/mL的柚皮苷，定为实验组进行后续实验研究。

表3 对照组与不同浓度柚皮苷组抑制人退变髓核细胞凋亡率（x±s）Tab.3 Control group and naringin group with different concentrations inhibit the apoptosis rate of human degeneration nucleus pulposus cells（x±s）

2.5 qRT－PCR 检测 Fas、FasL、Caspase-8 基因表达情况 20 μg/mL柚皮苷组比对照组可以明显抑制Fas、FasL、Caspase-8 基因的表达（P＜0．01）。柚皮苷组与对照组对于各个基因表达的影响，见表4。

3 讨论

图4 各组抑制人退变髓核细胞凋亡的流式细胞图片Fig.4 Flow cytometry in each group to inhibit the apoptosis of degenerative nucleus pulposus cells

图 5 Western-blot检测 Fas、FasL、Caspase-8 蛋白表达Fig.5 Western-blot detection of Fas,FasL and Caspase-8 protein expression

表4 qRT-PCR检测相关凋亡基因（x±s）Tab.4 qRT-PCR detection of related apoptotic genes（x±s）

腰椎间盘髓核组织主要由髓核细胞、蛋白多糖、糖胺多糖Ⅰ、Ⅰ型和Ⅱ型胶原及水分构成。成人髓核细胞为类软骨细胞，主要分泌蛋白多糖、糖胺多糖、Ⅱ型胶原等细胞外基质[3]。随着髓核细胞凋亡增加，细胞外基质含量下降，水分减少，椎间盘退变趋势明显增加。而细胞外基质的减少会进一步加剧髓核细胞的凋亡，形成恶性循环，腰椎间盘退变日趋加重[4]。本实验采用人退变椎间盘髓核组织，分离培养其细胞，番红O染色阳性显示细胞分泌蛋白多糖，甲苯胺蓝染色阳性说明细胞可以分泌Ⅱ型胶原，证明此为髓核类软骨细胞。

腰椎间盘退变中医属“腰痹”范畴，病机主要为肝肾亏虚，筋脉失养。中药骨碎补具有补肾壮骨、续伤止痛的作用，常用于腰椎间盘退变的治疗。柚皮苷是黄酮类物质，是中药骨碎补主要单体成分之一，具有抗炎、抗氧化、促进骨形成、抑制骨破坏、促进神经细胞再生及修复等作用[5]。有研究显示，柚皮苷能有效地促进人退变髓核细胞的增殖，提高细胞活性，这可能与其促进髓核细胞蛋白多糖、骨形态发生蛋白-2（BMP-2）的表达，抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、SOX6和基质金属蛋白酶-3（MMP-3）的表达相关[6-7]。本实验通过MTT法和流式细胞法检测20 μg/mL柚皮苷为抑制人髓核细胞凋亡的最佳浓度，与相关文献报道一致，并用此浓度柚皮苷进行相关基因及蛋白检测。

细胞凋亡，又称程序化细胞死亡，是由基因调控的细胞主动死亡过程[8]。其凋亡途径主要有3条：死亡受体复合体通路（膜受体通路）、线粒体通路和内质网通路。死亡受体通路主要包括TNFR途径、TRAIL途径、Fas/FasL途径。细胞凋亡可能通过Fas/FasL系统触发死亡信号复合体介导途径实现。死亡受体通路中，Fas与FasL结合后，形成死亡诱导信号复合体，启动Caspase-8/Caspase-10，可以通过Bid等细胞因子转导，或直接激活凋亡执行蛋白Caspase-3等，完成细胞凋亡[9-10]。qRT-PCR结果显示柚皮苷组可以下调Fas、FasL、Caspase-8基因表达，Western-blot结果显示柚皮苷可以抑制Fas蛋白表达，说明柚皮苷可能通过调控Fas/FasL死亡受体通路，抑制髓核细胞凋亡。

本实验结果显示，柚皮苷可能通过调控Fas/FasL死亡受体通路抑制人髓核细胞凋亡，为临床治疗腰痛提供新的途径。但是柚皮苷抑制髓核细胞凋亡机制较为复杂，是否还通过其他途径，需要进一步验证。相信随着椎间盘退变研究的逐步深入，对其退变机制认识逐渐深刻，会有更多、更有效的治疗手段服务于广大患者。

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