通腑泻肺方对ALI/ARDS大鼠AQP1/a-ENaC表达的影响

廉 富，苏景深，刘恩顺，郑 莉，赵鑫民，陈善夫

急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种炎症反应，多种炎症介质和细胞因子参与发病，失控的炎症反应损伤肺泡毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞，导致肺水清除能力下降，肺含水量增加，形成肺水肿,气体交换障碍,从而导致严重低氧血症[1]。水通道蛋白（AQPs）是一组在哺乳动物体内表达的水选择通道的分子家族，可以增强浆膜面水通透力的功能，因而可以提供快速液体转运的通路[2]。肺上皮细胞钠通道（ENaC）由α、β和γ 3个亚型组成，广泛分布于肺Ⅰ型[3]和Ⅱ型[4]上皮细胞，是肺泡腔水肿液清除（AFC）的关键作用环节。本研究探讨了内毒素（LPS）诱导的急性肺损伤大鼠模型中AQP1和a-ENaC蛋白的表达调节及通腑泻肺中药干预的作用。

1 材料

1.1 动物 健康SD大鼠27只，雄性，体质量（200±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司（许可证号：SCXX（京）2012－0001），购入后置天津工程所实验中心常规饲养。

1.2 药物及试剂 通腑泻肺方（葶苈子、桑白皮、大黄、枳实、厚朴）中药颗粒剂，购自天津中医药大学第二附属医院药房。大肠杆菌内毒素脂多糖购自Sigma公司。AQP1抗体购自Abcam公司，批号：Ab11025；a-ENaC抗体购自Proteintech公司，10924-2-AP。免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物公司。

2 方法

2.1 ALI/ARDS模型的建立及分组给药 动物购入后适应性饲养1周，将大鼠按体质量随机分为空白组、模型组、中药组，每组9只。模型组与中药组于左侧尾静脉注射内毒素8 mg/kg，复制ALI/ARDS模型。正常对照组大鼠静脉注射生理盐水。对照组与模型组在造模完成后即用生理盐水灌服，每次0.01 mL/g。治疗组在造模完成后给予通腑泻肺中药灌胃，每次0.01 mL/g，每日1次，共7 d。

2.2 镜下观察 给药1周后，取右肺下叶，应用10%甲醛溶液进行固定，常规石蜡切片，进行苏木精-伊红（HE）染色检测。光镜下观察，比较分析各组大鼠肺组织病理学改变。

2.3 免疫组化染色方法检测检测肺组织AQP1和a-ENaC的表达 将组织切片行脱蜡、水化处理后，高压修复抗原，用3%过氧化氢溶液消除内源性过氧化酶，血清封闭后各组切片分别加入兔源性AQP-1、a-ENaC多克隆抗体（均为1∶100稀释），4℃过夜后加入兔二抗，经二氨基联苯胺（DAB）显色，光镜下观察。AQP-1、a-ENaC的阳性反应产物均呈棕黄色。光学显微镜下随机观察5个视野、拍照，代表该动物肺组织AQP-1、a-ENaC的蛋白表达强度。应用Image-Pro Plus6．0软件分析阳性细胞数，同时将空白对照组阳性细胞率设置为100%，计算其他组别的阳性细胞率，并对结果进行统计分析。

2.4 统计学方法 采用SPSS 19．0统计软件包进行统计分析，数据以均数±标准差（x±s）表示。多组比较用单因素方差分析，组间两两比较采用Newman-Keuls检验，P＜0．05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 肺组织病理学表现 空白组大鼠肺组织光镜下可见大部分肺泡结构正常、充盈良好，无肺泡萎陷；少部分肺泡间隔增宽、充血、少量淋巴细胞浸润，未见肺泡萎陷；灶性肺间质、细支气管周少量淋巴细胞浸润。模型组大鼠肺组织光镜下可见广泛肺泡萎陷，肺泡间隔增宽、充血、较多淋巴、中性粒细胞、巨噬细胞浸润，局部呈实性。部分肺泡腔可见少量红细胞、淋巴、中性粒及巨噬细胞渗出；部分细支气管及终末细支气管周可见大量淋巴细胞浸润、淋巴组织增生。中药组大鼠肺组织镜下大部分肺泡结构正常、充盈良好，无肺泡萎陷；部分肺泡间隔增宽、充血、纤维组织增生，较多淋巴细胞为主的炎细胞浸润，可见肺泡萎陷；偶见细支气管周灶性淋巴细胞浸润，见图1。

图1 大鼠肺组织形态学改变(SP,×100)Fig.1 Histology changes of lung in rats(SP,×100)

3.2 AQP1和a-ENaC在肺组织的分布及表达情况 空白组大鼠肺组织中AQP1和a-ENaC均呈高水平表达，AQP1主要分布在肺组织微血管的内皮细胞膜，以及少部分分布在肺上皮细胞膜，见图2。a-ENaC主要分布在肺泡细胞膜，见图3。与空白组比较，模型组可见 AQP1 表达显著下降（P＜0．01）；中药组经过治疗干预后，AQP1表达增强，差异具有统计学意义（P<0．05）。与空白组比较，模型组可见a-ENaC 表达显著下降（P＜0．01）；中药组经过治疗干预后，a-ENaC 表达增强，差异具有统计学意义（P＜0．01）。见表1。

图2 AQP1在肺组织的分布与表达(SP,×400)Fig.2 Distribution and expression of AQP1 in lung tissue(SP,×400)

图3 a-ENaC在肺组织的分布及表达(SP,×400)Fig.3 Distribution and expression of a-ENaC in lung tissue(SP,×400)

表1 大鼠肺组织AQP-1、a-ENaC免疫组织化学表达的平均光密度值（x±s）Tab.1 The mean optical density of AQP-1 and a-ENaC in lung tissue of rats（x±s）

4 讨论

ALI/ARDS状态下肺微血管的通透性增高，肺泡上皮受损，导致大量血管内液渗透到肺间质及肺泡内，引起肺泡内及肺间质大量肺水形成的高通透性水肿[5]。研究发现的AQPs包括AQP 0～12共13种亚型。其中，AQP-1主要分布于微血管内皮细胞、支气管周围血管床、气管黏膜、淋巴管、胸膜和Ⅱ型肺泡上皮细胞[6]。敲除AQP1基因的小鼠肺泡毛细血管通透性较野生型发生显著改变，肺泡毛细血管膜屏障通透性下降10倍左右[7]。ENaC通过主动吸收肺泡腔内的钠离子实现的肺泡液体吸收主要途径,是肺水肿清除的决定因素[8]。ENaC主动转运将肺泡腔内的钠离子转运入肺泡Ⅱ型细胞内，随后位于基底膜的钠/钾ATP酶再将钠离子转运至肺间质，其中主动转运为肺水肿液清除提供了源动力，将肺水肿液体继发性主动转运至间质，并通过静脉和淋巴回流，从而减轻肺水肿。整个转运过程中90%的跨膜转运阻力存在于ENaC中，因此ENaC是肺泡腔内钠水重吸收的限速步骤[9]。a-ENaC基因敲除小鼠因肺水肿液清除能力低下而在出生后死于ARDS[10]。

通腑泻肺方药源自中医学“肺与大肠相表里”理论，肺与大肠通过经脉相连，两者在生理功能上相互协调，而在发生病理变化时又相互影响。通腑用小承气汤，方中大黄具有破积聚、荡涤胃肠等功效。厚朴行气散满，枳实破气消痞，诸药合用，可以轻下热结，除满消痞。泻肺用葶苈子，性大寒，味辛、苦，归肺、膀胱经，功能泻肺平喘，行水消肿；桑白皮，甘寒入肺，功能泻肺平喘，利水消肿。上述两者合用为通腑泻肺方，既可泻肺平喘，又能通腑泻热，肺肠同治。前期研究发现通腑泻肺方可以明显减轻ALI/ARDS大鼠炎症因子水平的表达，减轻肺部的炎症反应[11-12]。

实验结果发现，通腑泻肺中药组肺组织病理损伤减轻，免疫组化方法检测发现其可上调肺组织AQP1和a-ENaC表达。提示通腑泻肺中药减轻ALI/ARDS大鼠肺水肿的机制可能在于其提高AQP1和a-ENaC表达，促进肺水肿的吸收，为临床治疗提供了新思路。

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