大鲵黏液糖蛋白的抗氧化及防紫外作用

2018-06-19董渭雪陈德经

陕西理工大学学报(自然科学版) 2018年3期

董渭雪，陈德经，2*，辛茜，杨慧

(1.陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西汉中 723000;2.陕西理工大学陕西省资源生物重点实验室，陕西汉中 723000)

大鲵(Andrias davidianus )属大型两栖纲、有尾目、隐鳃鲵科，又叫“娃娃鱼”，国家二级保护两栖野生动物。大鲵皮肤腺体主要有两种:液腺和颗粒腺，皮肤腺体中的黏液腺体细胞释放的物质与水结合后形成黏液[1]。糖蛋白是一种长度较短，由带有分支的寡糖和多肽链通过共价结合而形成的物质[2]，在自然界中，糖蛋白广泛存在于动物、植物和一些微生物中，是生命活动的重要物质，细胞的识别及体内功能多为糖蛋白介导，以不同的形态存在于生物体内发挥着作用，且糖蛋白是细胞膜、血浆、激素、细胞间基质的重要组成部分[3]。有文献报道，从大鲵黏液中分离得到的糖蛋白具有调节免疫、抗肿瘤、抗炎、降血糖、降血脂、抗氧化、防衰老等功效。徐伟良[4]通过对大鲵黏液组分分析发现其主要成分包括糖、脂肪、蛋白质，其中黏液蛋白中含有甘露糖、葡萄糖醛、半乳糖醛酸、N-乙酰氨基葡萄糖、葡萄糖和半乳糖共6种单糖组分，共检测出17种氨基酸，且氨基酸总含量为61.86%。大气中臭氧层每递减1%，皮肤癌的发病率就会上升3%，造成日光性皮炎甚至皮肤癌患者明显增加[5]。有科学家对从藻胆中分离出的蛋白进行体外抗紫外辐射活性实验，发现其对UVA辐射损伤的小鼠纤维细胞具有修复作用[6]。唐倩[7]通过测定不同紫外辐照时间对胞外多糖抗辐射率的影响得出多糖是一种生物活性物质，具有清除自由基和抗氧化的作用，可以有效地改善和提高机体的免疫能力以及许多方面的生理功能。

本文旨在研究大鲵黏液糖蛋白对DPPH·自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基的清除作用，以及检测大鲵黏液糖蛋白保护大肠杆菌抵抗紫外线影响的能力。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

大鲵黏液冻干粉(自制);NaOH、无水乙醇(天津市耀华化学试剂有限责任公司);抗坏血酸(成都市科龙化工试剂厂);DPPH·(北京索莱宝科技有限公司);三羟甲基氨基甲烷(上海源叶生物科技有限公司);正丁醇(天津市天力化学试剂有限公司);氯仿(天津市外环化工有限公司);胰蛋白胨、酵母浸提物、琼脂(北京奥博星生物技术有限责任公司)，以上试剂均为分析纯。

1.2 实验仪器

SB-3200DTD超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司);LC-800低速离心机(科大创新股份有限公司);RE52-05旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);AL204万分之一电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司);UV-1550紫外可见分光光度计(岛津公司);SPX-250B-Z生化培养箱(上海博迅实业有限公司);LGJ-10B冻干机(北京四环科学仪器厂有限公司);THZ-82恒温震荡培养箱(金坛市科析仪器有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 大鲵黏液糖蛋白的提取

碱提：称取50.000 g大鲵黏液冻干粉，以0.4 mol/L的NaOH溶液，料液比为1∶20，溶解黏液，在45 ℃下水浴提取2 h，提取液以4000 r/min离心15 min，回收上清液200 mL。

醇沉：上清液中加入无水乙醇，至终浓度为76%，用稀HCl调节溶液pH至7.0左右，置于4 ℃冰箱中静置醇沉8 h。离心去除上清液，将糖蛋白沉淀用无水乙醇洗涤3次后，真空干燥得大鲵黏液糖蛋白粗品[4]。Sevage法脱蛋白：按体积比3∶1将Sevage溶液(氯仿∶正丁醇=3∶1)与粗多糖溶液一起加入分液漏斗中，剧烈摇晃15 min，溶液以4000 r/min离心15 min，弃去中间层的变性蛋白与下层的溶液，上述做法重复3次，得到较高纯度的糖蛋白溶液。最后对糖蛋白溶液进行真空冷冻干燥48 h。并利用以下公式计算得率：

(1)

1.3.2大鲵黏液糖蛋白的抗氧化活性检测

1.3.2.1 清除DPPH·自由基的检测方法

用蒸馏水配制浓度为0、0.02、0.06、0.10、0.14、0.18 mg/mL大鲵黏液糖蛋白溶液，将梯度稀释的样品溶液各取3 mL，分别加入到3 mL浓度为0.2 mmol/L的DPPH无水乙醇溶液中，充分混匀，然后避光静置30 min，其中空白组为蒸馏水，阳性对照为抗坏血酸。最后使用紫外分光光度计在波长516 nm处测定样品的吸光值，每一个样品做3组平行样。按照下式计算不同浓度待测物的DPPH自由基清除率[8]:

(2)

式中A0为空白组的吸光度,A为样品溶液的吸光度。

1.3.2.2 清除超氧阴离子自由基(O2-·)的检测方法

用蒸馏水配浓度为0、0.02、0.06、0.10、0.14、0.18 mg/mL大鲵黏液糖蛋白溶液，将梯度稀释的样品溶液各取1 mL于试管中，然后加入4.5 mL Tris-HCl缓冲液和0.1 mL浓度为3 mmol/L的邻苯三酚溶液，于25 ℃条件下反应5 min，最后加入1 mL浓度为8 mmol/L的HCl溶液使得反应终止，其中空白组为蒸馏水，阳性对照为抗坏血酸，使用紫外分光光度计在波长298 nm处测定样品的吸光值，每一个样品做3组平行样[1]。按照(2)式计算不同浓度待测物的超氧阴离子自由基清除率。

1.3.2.3 清除羟基自由基(·OH)的检测方法

用蒸馏水配制大鲵黏液糖蛋白，浓度分别为0.00、0.20、0.60、1.00、1.40、1.80 mg/mL，将梯度稀释的样品溶液各取2 mL于试管中，分别加入2 mL浓度为6 mmol/L的FeSO4溶液、2 mL浓度为6 mmol/L的水杨酸乙醇溶液，最后加入2 mL浓度为8 mmol/L的H2O2溶液使得反应启动，于37 ℃下水浴加热30 min后，取出试管使反应终止，其中空白组为蒸馏水，阳性对照为抗坏血酸，使用紫外分光光度计在波长510 nm处测定样品的吸光值，每一个样品做3组平行样[9]。按照(2)式计算不同浓度待测物的羟基自由基清除率。

1.3.3 大鲵黏液糖蛋白的抗紫外性试验

称取0.200 g黏液糖蛋白，用蒸馏水定容至50 mL，将一组溶液放在平皿中在紫外灯下进行长时间照射(0、10、20、30、40、50、60 min)，另一组溶液在紫外灯下进行短时间照射(0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 s)，然后在280 nm测定两组溶液的吸光度，绘制吸光值变化曲线。

1.3.4 大肠杆菌评价大鲵黏液糖蛋白抗紫外作用

1.3.4.1 菌种的选育

大肠杆菌有清楚的遗传背景，具有成本低、易于培养、繁殖速度快等优点，所以本实验选用肠杆菌科代表菌种大肠埃希氏菌作为接受紫外辐射的细菌载体，用来评价大鲵黏液糖蛋白抗紫外作用。

1.3.4.2 制备培养基

使用LB固体培养基，依照标准配方称取胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化钠10 g、琼脂粉20 g，量取900 mL蒸馏水将上述试剂依次加入，并且对溶液进行加热使其完全溶解，使用浓度为1 mol/L的NaOH溶液调节培养基pH至7，然后加入蒸馏水至培养基体积为1000 mL，高温高压灭菌20 min后倒平板，最后将培养基置于无菌操作台冷却至室温。

另外试验中还使用到了LB液体培养基，依照标准配方分别称取胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化钠10 g，将上述试剂依次加入900 mL蒸馏水，并且对培养基进行加热使其完全溶解，使用浓度为1 mol/L的NaOH溶液调节液体培养基pH至7，加入蒸馏水至培养基体积为1000 mL，以每个试管4 mL的量将制备好的液体培养基倒入，高温高压灭菌20 min。最后将所有试管密封放置于无菌操作台。

1.3.4.3 大肠杆菌菌悬液的制备

从冰箱中取出保存的大肠杆菌冻干粉，活化后，将菌悬液接种于预先配置好的LB液体培养基里，放入恒温震荡培养箱内培养至OD值为0.8。

1.3.4.4 测定大肠杆菌紫外照射存活率

将试管中的菌悬液进行梯度稀释10、100、1000倍，每3个梯度为一组，共10组。将试管放在距离紫外灯30 cm处，对每一组试管进行时长为0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 s的紫外灯照射，然后进行涂布平板，最后将所有平皿放入生化培养箱进行35 ℃、24 h恒温培养，24 h后利用平板计数法计数。细菌紫外照射存活率公式：

(3)

1.3.4.5 测定加入黏液糖蛋白后的大肠杆菌紫外照射存活率

重复实验步骤1.3.4.1、1.3.4.2、1.3.4.3，将试管拿出震荡培养箱之后，在菌悬液各取1 mL，加入7 mL浓度分别为0.9 mg/mL、1.8 mg/mL的黏液糖蛋白溶液中，然后重复步骤1.3.4.4[7]。

2 结果与分析

2.1大鲵黏液糖蛋白的提取结果

提取出1.66 g大鲵黏液糖蛋白，根据式(1)计算大鲵黏液糖蛋白得率为3.32%。

2.2 大鲵黏液糖蛋白抗氧化能力测定

2.2.1 清除DPPH·自由基检测结果

测定大鲵黏液糖蛋白和抗坏血酸对DPPH·自由基的清除作用结果如表1所示，可知大鲵黏液糖蛋白对DPPH·有清除作用，并且蛋白的抗氧化能力随浓度的增大而增大，且在浓度为0.14 mg/mL后上升趋势趋于平缓，但是抗氧化效果没有抗坏血酸的抗氧化效果强。

表1 DPPH·自由基的清除率

2.2.2 清除超氧阴离子自由基(O2-·)的检测结果

测定大鲵黏液糖蛋白和抗坏血酸对超氧阴离子自由基(O2-·)的清除作用结果如表2所示，可知大鲵黏液糖蛋白对超氧阴离子自由基有清除作用，并且蛋白的抗氧化能力在大鲵黏液糖蛋白浓度小于0.14 mg/mL时呈一定的量效关系，且在浓度低于0.02 mg/mL时上升趋势较为平缓，从表中可明显看出浓度从0.14 mg/mL后清除率出现下降，猜测是因为浓度变大导致溶液吸光度变大，从而清除率减小，但是抗氧化效果没有抗坏血酸的抗氧化效果强。

表2 超氧阴离子自由基(O2-·)的清除率

2.2.3 清除羟基自由基(·OH)的检测结果

测定大鲵黏液糖蛋白和抗坏血酸对羟基自由基(·OH)的清除作用结果如表3所示，可知大鲵黏液糖蛋白对羟基自由基有清除作用，并且蛋白的抗氧化能力随浓度的增高而增高，且浓度大于0.2 mg/mL后上升趋势明显增大，但是抗氧化效果没有抗坏血酸的抗氧化效果强。

表3 羟基自由基(·OH)的清除率

2.3 大鲵黏液糖蛋白的抗紫外性实验结果

测定长时间紫外照射下大鲵黏液糖蛋白的抗紫外作用结果如图1所示，大鲵黏液糖蛋白在紫外灯下照射10 min内其吸光度上升较快；在往后的50 min内上升趋势较为平缓。大鲵黏液糖蛋白的吸光度随着紫外灯照射时长的增加而增大，说明大鲵黏液糖蛋白能够吸收紫外线，因此具有抗紫外能力，保护载体不受紫外线伤害。

测定短时间紫外照射下大鲵黏液糖蛋白的抗紫外作用结果如图2所示，大鲵黏液糖蛋白经紫外灯照射后吸光度整体呈上升趋势，在10～30 s吸光度上升趋势缓慢，30～90 s吸光度快速上升。对比图1可知，该上升趋势会继续维持。

图1 长时间紫外照射大鲵黏液糖蛋白吸光度图2 短时间紫外照射大鲵黏液糖蛋白吸光度

2.4 保护大肠杆菌抵御紫外效果实验结果

图3 紫外照射大肠杆菌的存活率

测定大鲵黏液糖蛋白保护大肠杆菌抵御紫外效果实验结果如图3所示，空白组在10 s时存活率为95.61%，存活率小幅度下降，在10～30 s存活率从95.61%直线下降到25.98%，出现了大幅度的下降，在30～90 s存活率仍在下降但趋势趋于平缓，90 s时存活率降至0.98%；样品浓度为0.9 mg/mL时，照射时长20 s以内细菌存活率小幅度下降，照射时长20～40 s细菌存活率出现大幅度下降，照射时长40 s后细菌存活率下降趋势又趋于平缓；样品浓度为1.8 mg/mL时，30 s之前存活率小幅度下降，但都高于90%，30～60 s细菌存活率大幅度下降，60 s后下降趋势又趋于平缓。对比3组数据，发现大肠杆菌的存活率最终接近于0是必然趋势，而样品组的大肠杆菌存活率均大于空白组，证明大鲵黏液糖蛋白有抗紫外作用，一定程度上减缓了大肠杆菌的死亡时间；样品浓度为1.8 mg/mL时的细菌存活率大于样品浓度为0.9 mg/mL时的细菌存活率，证明大鲵黏液糖蛋白的抗紫外作用与浓度呈正相关的量效关系。并且本实验也进一步验证了2.3中“大鲵黏液糖蛋白能够吸收紫外线，因此具有抗紫外能力，保护载体不受紫外线伤害”这一结论。