三种培养基对人脐带间充质干细胞培养生长和数量影响的比较

高健伟，郭红燕，李艳生

人脐带间充质干细胞在实验及临床有广泛的应用，取得了很多很好的成果，逐渐成为人们研究的热点；但干细胞的培养扩增还存在较多问题，很多因素都可能导致原代干细胞体外培养失败（如选择培养基、血清、脐带质量、无菌情况、技术操作等），即使成功培养间充质干细胞 （mesenchymal stem cells，MSCs），其生长状态不良、数量少、细胞收集不足等情况，影响实验结果。笔者对目前使用的三种不同培养基进行原代干细胞培养，对其观察细胞培养数量的结果具体分析如下。

1 材料与方法

1.1 培养基、试剂和仪器 低糖DMEM、高糖DMEM、DMEM/F12（均使用 HyClone），青霉素和链霉素 100×（Solabio），15%FBS（Gibco），培养皿（美国康宁），倒置显微镜 （100×），荧光倒置显微镜（100×）。

1.2 不同培养基的培养皿孔数计数 全部采用同一厂家6孔培养板，同一培养板只能用一种培养基，共3板，1孔为一份标本，共18份标本。

1.3 培养时间和观察内容 不同培养时间点，分别是 7、10、15、20、25 d， 在不同时间点观察不同培养基对细胞游出面积、细胞计数的影响。

1.4 脐带采集和培养 人脐带间充质干细胞原代培养采用组织块贴壁法进行，同一婴儿的脐带进行三种不同培养基培养。足月、健康剖腹产产妇的新鲜、无菌、健康的新生儿脐带长约24 cm，用4℃无菌恒温盒储存运输，即刻消毒，用PBS（含1∶1000的青霉素和链霉素）反复冲洗表面血迹和血管内残留血液，清洗彻底干净，随后用组织剪剪取干净、清亮、饱满部分的脐带，每一段长约1 cm，挑选取用18段用PBS再次反复冲洗。冲洗干净后用血管钳和眼科剪细心分离先将脐带静脉和动脉去除，然后去除羊膜，剩余即为华通胶。取无菌一次性培养皿用眼科剪将华通胶一般剪成1 mm×1 mm×1 mm组织块，平均分别种在一次性无菌6孔板的培养板底部，随后把培养板放在37℃，5%CO2恒温孵育箱中1.5～2.5 h。1.5～2.5 h后取出在超净操作台上用加液器缓慢小心分别加入DMEM低糖、DMEM高糖、DMEM/F12培养液（含1∶100的青霉素和链霉素）。倒置显微镜下观察未见异常后置于37℃，5%CO2恒温孵育箱内培养，孵育期间要更换培养基。

2 结果

2.1 细胞游出面积和细胞计数情况 在相同的培养条件下，采用足月、健康剖腹产产妇的新鲜、无菌、健康的新生儿脐带。以每厘米脐带培养进行比较计数，三种不同培养基细胞游出概率及细胞计数比较见表 1、2。

2.2 人脐带MSCs形态学特性 人脐带华通胶行组织块贴壁法培养间充质干细胞，分别应用A组、B组、C组进行培养。观察7 d、15 d细胞发现：A组B组细胞游出时间偏长，数量较少，成功概率下降，镜检发现干细胞游出少，瘦小，生长缓慢，呈索状偏长，细胞排列稀疏；C组细胞游出时间较短，数量较多，大片呈集落群体生长，生长迅速，增殖较快，成功概率较高，镜检发现干细胞游出较多，体积较大，呈条索状或菱形偏长，形态均一，大多数平行生长，细胞融合及细胞排列紧密，多数可出现多层细胞，细胞生长旺盛［1，2］。

表1 不同培养基细胞不同时点游出面积百分比（%）

表2 不同培养基不同时点细胞计数（每厘米脐带）

2.3 不同培养基及不同时间段对原代细胞培养的影响 通过三种不同培养基进行原代干细胞培养发现：在三种培养基中C组培养为最佳；B组次之，A组一般。

采用SPSS 13.0统计软件进行重复测量方差分析，结果显示，三种不同培养基及不同时间段比较，P＜0.05，差异具有统计学意义。结果还显示，P值（Sig）均＜0.05。

认为DMEM低糖和DMEM高糖、DMEM高糖和DMEM/F12、DMEM/F12和DMEM低糖三组之间对比对细胞生长差别有统计学意义。

3 讨论

人脐带间充质干细胞 （human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUC－MSCs）起源于成体干细胞的中胚层，来源于脐带的华尔通胶或叫沃顿胶（whartoncs jelly，WJ），是具有自我更新和多向分化的多能干细胞，参与神经的修复，促进多种有利因子的产生，在其组织内可以进行迁移、整合、调节、分泌等作用，在脊髓损伤的修复治疗方面较其他干细胞治疗更具有明显优势［3－11］，成为目前干细胞研究的焦点和热点。

脐带处理要求清洗干净，必须选择足月剖腹产健康胎儿的新鲜脐带，低温保存4 h内处理，时间越短越好，最好不要超过24 h；李铎等［12］对脐带进行24 h内处理，HUC－MSCs获得量及分离成功率高，随时间延长获得量减少，分离成功率降低。窦慧慧［13］应用MesencultTM培养基对原代细胞进行培养发现细胞培养成功率达到100%；但其价格较高，适于专业干细胞技术人员。

人脐带间充质干细胞原代培养对培养基的选择十分重要［14－16］，对今后培养成功起着关键决定性作用；一般科研院校学生应用DMEM/F12培养基已足够，价格低，经济实惠；应用MesencultTM培养基价格太高。FBS浓度一般控制在10%～20%，该研究经过多次浓度配比比较发现采用15%的培养基效果较好。个别干细胞需要更高浓度的培养基。A组加15%FBS加1%青链霉素双抗，行人脐带华通胶原代培养时间一般情况下比同期干细胞培养延长3天，细胞生长缓慢，贴壁率低；B组加15%FBS加1%青链霉素双抗，行人脐带华通胶原代培养一般情况下最早开始5 d就可见干细胞贴壁生长，10 d左右干细胞自组织块游离出来越来越多，14 d开始贴壁生长逐渐旺盛，22 d左右细胞生长开始逐渐变得缓慢；C组加15%FBS加1%青链霉素双抗，3 d就可见少量干细胞贴壁生长，5 d可见明显生长，7 d左右干细胞自组织块游离出来越来越多，14～22 d左右贴壁生长最为旺盛，比A组B组效果明显。一般情况下17～20 d传代最好，25 d左右贴壁细胞生长变慢，27 d基本停止生长或老化，最长培养35 d细胞贴壁生长未再见明显变化。

通过培养发现细胞生长形态有所不同，A组培养基培养贴壁细胞生长缓慢，排列稀疏，细胞干瘪瘦小，整体体积小；B组培养的细胞生长迅速，细胞体积变大，整体体积明显增大，后期集落群体明显细胞密集；C组培养细胞生长形态均一，胞体饱满，细胞状态及密集度更高，较前两组效果更好；同时发现脐带 MSCs 体外增殖较快较高等多种优点［17，18］。

综上所述，采用DMEM/F12培养基+15%FBS联合培养所取得的原代干细胞形态均一，生长良好，质量较高，成分较纯，解决了原代细胞培养生长不良，游出率较低，细胞较少，成功率较低等难题，对人脐带间充质干细胞原代培养提供了有力依据，为提高实验研究和培养成功率奠定了良好基础［19］。

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