二甲双胍对结肠癌细胞增殖的影响

张斯萌 张晔 车晓芳 曲秀娟 刘云鹏

结直肠癌是世界范围内高发病率及高死亡率的恶性肿瘤之一。在我国，根据最新的研究统计，结直肠癌在近年来发病率与死亡率均呈上升趋势［1］。尽管手术治疗能够作为早期结直肠癌的根治手段，但是仍有近一半的患者会进展到晚期。药物治疗是治疗转移性结直肠癌的主要方式。然而，肿瘤的异质性以及耐药的发生却极大限制了药物的作用和疗效，因此，进一步筛选有效的治疗药物是解决上述问题的关键之一。二甲双胍是用于治疗II型糖尿病的口服双胍类降糖药。近来研究发现，二甲双胍除了降糖作用外，还具有抗肿瘤作用。一项荟萃分析的结果证实，二甲双胍能够有效改善前列腺癌与结直肠癌患者的预后［2］。在结直肠癌中，二甲双胍抑制肿瘤的作用尚不明确，本研究通过结肠癌细胞HT29为模型，探究二甲双胍对结肠癌细胞的抑制作用及可能机制。

资料与方法

一、主要试剂与仪器

（一）主要试剂

RPMI1640（Gibco公司）；胎牛血清（天津血液病研究所）；IGF1R、p-IFG1R、Akt、p-Akt、Erk、p-Erk、Actin抗体（美国 Cell Signalling Technology公司）；MTT（美国 Sigma公司）；羊抗鼠和羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗（北京中杉金桥技术有限公司）；ECL试剂盒（PIERCE 公司）。

（二）主要仪器

荧光显微镜（日本，OLYMPUS）；UP50超声粉碎仪（德国，Dr.Hielscher公司）；TLL-C台式高速冷冻离心机（北京四环科学仪器厂）；DYY-Ⅲ型电泳槽（北京市六一仪器厂）；Tanon EPS 300电泳仪（上海天能科技有限公司）；500型酶标仪（美国，BIO-RAD 公司）；CK 40倒置显微镜（日本，OLYMPUS 公司）；4 ℃/-20 ℃电冰箱（海尔集团公司）；-80 ℃深低温冰箱（日本，SANYO公司）；超净台（苏州净化设备厂）；SYQ·MDX-280高压锅（上海申安医疗器械厂）；HH·SII-1水浴箱（北京长安科学仪器厂）。

二、实验方法

（一）细胞培养

结肠癌细胞株HT29于本实验室进行常规传代培养，生长于含有10%灭活胎牛血清、12 U/mL庆大霉素的RPMI1640培养液中，于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱内培养，0.25%胰酶消化液消化传代，2～3天传代一次。所有实验均采用对数生长期细胞。

（二）MTT法检测二甲双胍对结肠癌细胞的抑制作用

将结肠癌细胞株HT29计数3 000个细胞，配置成200 μl 10%去除外泌体血清的条件培养基，混匀后种与96孔板，设置处理组及对照组，并将无细胞单独培养基设置为空白对照组，每组3个副孔。待细胞贴壁后加入不同浓度的二甲双胍（0、0.1、1、5、10 mmol/L），并放入37 ℃培养箱中孵育48 h。取出96孔板，于每孔加入20 μl MTT溶液，轻摇混匀，置于在37 ℃培养箱中4小时，弃上清后每孔加入200 μl二甲基亚砜（DMSO）溶液，置于水平摇床充分混匀5～10分钟，酶标仪在570 nm波长下检测光密度（OD）值，根据OD值计算西妥昔单抗对HT29细胞的增殖抑制率。

（三）蛋白免疫印迹法检测结肠癌细胞增殖信号通路变化

分别收集对照组与处理组细胞裂解于70 μl含有蛋白酶抑制剂（100 μg/mL PMSF，2 μg/mL Aprotitin） 的 RIPA裂 解 液 中［0.1%SDS，1%Triton-100，150 mmol/LNaCl，1 mmol/L EDTA（PH8.0），10 mmol/L Tris-HCl（PH 7.5）］，4 ℃裂解40 min，13 000 rpm离心20分钟，吸取上清，考马斯亮蓝方法进行蛋白定量。与3×样品缓冲液混合后，煮沸5分钟。将样品（30～50 μg/lane）在12%的SDS-聚丙烯凝胶中进行电泳2～3小时，然后转印至PVDF膜上（电压：2 mV/cm2；时间：120分钟）。用5%脱脂牛奶封闭1小时后，按预染Marker标记的分子量剪裁转印膜，分别加入兔抗人p-IGF1R（1：500）、IGF1R（1：1 000）、p-Akt（1：500），Akt（1：1 000），p-Erk（1：500），Erk（1：1 000），GAPDH（1：1 000）抗体4 ℃过夜。TTBS洗4次后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠（1：1 000）或羊抗兔二抗（1：1 000）室温作用30 min，ECL法显色，GIS凝胶图像分析系统照相并分析处理。

（四）统计学分析

所有数据均为3次独立实验结果，以均值±标准差（x±s）表示。采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。两组之间比较采用t检验，P＜0.05有统计学意义。

结 果

一、不同浓度的二甲双胍对结肠癌细胞HT29增殖的影响

利用不同浓度的二甲双胍（0、0.1、1、5、10 mmol/L）分别处理HT29 48 h，MTT实验检测二甲双胍对结肠癌细胞株增殖的影响。结果发现，在二甲双胍的作用下，HT29细胞株用药组相比对照组增殖率下降且呈二甲双胍浓度依赖性（1mM：t值=4.323，P＜0.05；5mM：t值=6.11，P＜0.01；10mM：t值=9.449，P＜0.001），说明二甲双胍能够抑制结肠癌细胞株HT29的增殖（图1）。

二、二甲双胍通过阻断胰岛素样生长因子受体（IGF1R）抑制下游蛋白激酶B（Akt）与细胞外调节蛋白激酶(ERK) 信号影响结肠癌细胞增殖

利用二甲双胍（5 mmol/L）分别处理HT29细胞0、2、4、8、16、24、48 h后，蛋白免疫印迹法检测增殖标志蛋白Akt、Erk表达变化。结果发现，在二甲双胍作用16、24、48 h，Akt与Erk磷酸化水平受到抑制，提示二甲双胍通过抑制Akt/Erk增殖信号通路实现抑制结肠癌细胞增殖的作用（图2）。为进一步探究其作用机制，利用二甲双胍（5 mmol/L）处理HT29细胞0、24、48 h，蛋白免疫印迹法检测Akt/Erk上游IGF1R蛋白表达变化，结果发现，在二甲双胍的作用下，IGF1R磷酸化水平受到抑制且呈时间依赖性，上述结果说明，二甲双胍通过阻断IGF1R及下游Akt/Erk信号进而抑制结肠癌细胞增殖（图3）。

讨 论

研究发现，二甲双胍可改善多种肿瘤的预后。在乳腺癌中，糖尿病患者接受二甲双胍联合新辅助化疗相比单纯应用新辅助化疗，具有更高的病理完全缓解（pCR）率，并且可作为pCR的独立预测指标［3］。Chen等［4］发现，在接受射频消融治疗后的糖尿病肝细胞癌患者，应用二甲双胍能够有效延长总生存。针对结直肠癌，二甲双胍同样能够提高糖尿病结直肠癌患者的生存获益［5］。相比之下，对于非糖尿病结直肠癌人群，二甲双胍对于预后的影响仍存在争议［2，6］。此外，对于结肠肠癌细胞，二甲双胍抑制肿瘤的作用机制尚不明确。本研究通过对结肠癌HT29细胞株的研究发现，不同浓度的二甲双胍能够抑制结肠癌细胞的增殖能力，证实二甲双胍对于结肠癌细胞的抑制作用。另有研究指出，二甲双胍能够通过阻滞细胞周期并下调细胞周期蛋白D1的表达抑制结肠癌细胞SW-480增殖［7］。为进一步探究二甲双胍抑制HT29细胞增殖的机制，利用蛋白免疫印迹法检测HT29细胞增殖相关蛋白Akt、Erk在二甲双胍作用下表达水平变化。结果发现，二甲双胍能够下调磷酸化Akt与磷酸化Erk的表达水平，证实其通过抑制Akt/Erk信号调节结肠癌细胞增殖。

二甲双胍作为降糖药，能够降低血浆中的胰岛素水平，而胰岛素与胰岛素样生长因子参与调节（insulin-like growth factors, IGFs）细胞生长与能量代谢［8］。IGFs与IGF1R相结合能够激活IGFs依赖性信号通路，促进肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移能力。既往研究发现，IGF1R能够激活下游Akt、Erk信号促进胃癌细胞增殖，而阻断IGF1R后，能够恢肠癌细胞对化疗的敏感性［9］。为进一步验证IGF1R是否参与二甲双胍对结肠癌细胞Akt、Erk蛋白表达的负向调控过程，利用二甲双胍处理HT29细胞后，蛋白免疫印迹检测IGF1R表达水平变化发现，IGF1R磷酸化水平受到抑制，证实二甲双胍能够通过阻断IGF1R抑制下游Akt、Erk信号负向调控细胞增殖。除了上述胰岛素依赖性调控机制以外，二甲双胍还可通过其他方式调节肿瘤的生物学行为。Shackelford DB等［10］发现，LKB1作为抑癌基因，是激活AMP依赖性激酶（Adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK）的关键上游分子。在LKB1缺失的非小细胞肺癌细胞中，利用二甲双胍类似物苯乙双胍处理能够激活AMPK并诱导细胞凋亡。与此同时，AMPK不仅能够负向调控肿瘤细胞的有氧糖酵解（Warburg effect）过程从而抑制肿瘤细胞生长，还能够通过激活结节硬化复合体2与1相结合，调节mTOR活性影响细胞生长［11］。此外，二甲双胍还可以通过依赖AMPK激活间接调节脂肪酸合成酶并影响肿瘤细胞的增殖［12］。在本研究中，二甲双胍是否能够通过上述机制调节结直肠癌细胞还需要进一步的探索。

图1 MTT验证不同浓度的二甲双胍（0、0.1、1、5、10 mmol/L）作用HT29细胞48小时后，细胞增殖率的影响。（*t值=4.323，P＜0.05；**t值=6.11，P＜0.01；***t值=9.449，P＜0.001) 图2 二甲双胍（5 mmol/L）作用HT29细胞不同时间后，对p-Akt，Akt，p-Erk，Erk与Actin蛋白表达的影响 图3 二甲双胍（5 mmol/L）作用HT29细胞0、24、48 h后，对p-IGF1R，IGF1R与Actin蛋白表达的影响

综上所述，二甲双胍能够通过阻断IGF1R，抑制下游Akt、Erk信号负向调控结肠癌细胞增殖。本研究结果证实二甲双胍在结肠癌细胞中的抗肿瘤作用，为深入探讨二甲双胍在结肠癌中的作用机制及进一步开展二甲双胍的临床研究提供了新的理论依据。

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