不同检查方法对乳腺癌侵犯NAC临床检出率的影响

董良鹏，张景航

（新乡医学院第一附属医院 河南 新乡 453100）

近100年来，乳腺癌的临床手术方式不断演变与革新。当今，肿瘤完整切除与乳房外形美容效果并重的理念在乳腺癌术式发展趋势中愈发成为主流。其中，乳头乳晕复合体（nipple-areola complex, NAC）被保留，对重建后好的乳房外形美容效果具有重要影响。作为一种全身性疾病，乳腺癌在发病早期，可通过血液发生远处转移[1-2]；NAC归属于乳腺导管系统，将其保留意味着在一定程度增加残留癌的风险。行保留NAC乳房切除术（nipple-areola complex sparing mastectomy,NSM）即乳腺癌改良根治术，预知NAC受癌侵犯的概率非常必要。然而关于乳腺癌侵犯NAC的临床检出率相关报道有差异，2008～2014年的文献显示为8.9%～28.0%，平均16.7%[3-14]。有学者指出，NAC的不同病理标本获取方式及检查方法是影响乳腺癌侵犯NAC临床检出率的重要因素[12]。本研究采用两种不同的NAC取材方法，分别经苏木精-伊红（hematoxylineosin, HE）染色与免疫组织化学法（简称免疫组化）染色（immunohistochemistry, IHC），旨在考察不同检查方法对乳腺癌侵犯NAC临床检出率的影响，继而为临床乳腺癌患者接受NSM术治疗提供可行性参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年1月-2016年11月在本院接受乳腺癌根治术治疗的原发性乳腺癌女性患者病理标本240例，采用随机数字表法分为观察组与对照组，各120例。其中，观察组病理标本所属患者年龄28～48岁，平均（37.4±8.2）岁；参照美国癌症联合委员会提出的乳腺癌分期标准，Ⅰ期33例，Ⅱ期87例。对照组病理标本所属患者年龄27～51岁，平均（38.6±9.4）岁；Ⅰ期39例，Ⅱ期81例。另同期选取已证实为乳腺癌与乳腺腺病患者各20例，将乳腺癌组织与乳腺腺病皮肤组织分别作为本研究IHC检查的阳性与阴性对照样本。乳腺癌病理组织标本排除标准：①明确为Paget's病；②合并NAC肉眼可见异常，如凹陷、溃疡破损、出血溢液、湿疹样改变、乳头后方扪及肿块等；③术前有接受新辅助化疗治疗；④初治时已发生有远处转移。

1.2 方法

1.2.1 取材 对照组于乳头的正中矢状面进行取材，取材深度5 mm；观察组取乳头与乳晕皮肤以及连同皮下10 mm的整块组织，采用本院自创5刀法：于乳头正中矢状面切1刀作为首刀，再根据患者乳头实际大小平行首刀于两侧每隔1～2 mm各切2刀，最后在乳头根部一分为二。

1.2.2 检查 分别经常规HE及IHC处理后镜检。IHC处理方法为：选择细胞角蛋白19（cytokerantin-19,CK-19）为目标蛋白，抗体及相关试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。将取得的组织标本经10%甲醛固定，再经脱水、透明、浸蜡及包埋程序处理后，4 μm连续切片，采用En Vision 2步法，将切片经烤片、脱蜡，逐级乙醇由高至低至入水，入3%过氧化氢液5 min，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）浸3遍，5 min/遍，放入pH 6.0柠檬酸缓冲液中高温高压修复：高压锅喷气后，加热2 min，改中火2 min，之后关火并持续焖10 min，结束后放至冷水中冷却至37℃并进行1 min胃酶消化，放入PBS缓冲液洗3遍，加CK-19一抗（鼠抗人单克隆抗体），4℃冰箱孵育过夜，PBS缓冲液浸3遍，5 min/遍，加二抗PV6000（通用型抗体）37℃ 10 min，PBS缓冲液浸3遍，DAB显色，苏木素复染，乙醇由低至高浓度逐级脱水至入二甲苯，封片。完成后由2位经验丰富的检验科诊断医师共同评估，所得结果定为最终的病理诊断结果。以镜检中观察到细胞膜细胞浆内有棕黄色颗粒为阳性。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计数资料以率（%）表示，比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

20例已证实为乳腺癌的乳腺癌组织经IHC处理后检查结果显示均为阳性，20例已证实为乳腺腺病的乳腺腺病皮肤组织织经IHC处理后检查结果显示均为阴性。将乳腺癌侵犯NAC的检出情况分别进行组内及组间比较，结果显示：两种方法处理后的检出率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），观察组IHC处理后的检出率高于HE检出率；对照组两种方法处理后的检出率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；经HE处理后，两组患者检出率比较差异无统计学意义（P＞0.05）；经IHC处理后，观察组检出率高于对照组（P＜0.05），见附表和图1～ 2。

附表 两组患者乳腺癌侵犯NAC的检出率比较[n =120，例（%）]

图1 NAC癌细胞侵犯 （HE ）

图2 NAC癌细胞微侵犯 （IHC）

3 讨论

在理想控制肿瘤病情的基础上最大程度提升手术美容效果是现代乳腺外科的重要目标之一[15]。传统乳腺癌乳房切除术通常要求先将NAC切除，乳房重建手术时一并将其重建。相关资料显示，有36%的乳房重建患者对乳头重建效果并不满意，甚至由此诱发心理问题[16]。FREEMAN[17]1962年首次提出NSM术式和相关理念，但该术式对乳腺癌治疗的安全性曾一度引发争议。随着对乳腺癌生物学特性认知的加深及其治疗手段的持续进步，目前多个医疗机构通过大样本前瞻性试验证实NSM在长期生存率方面已愈发趋近传统根治术[18]。尽管如此，关于NSM治疗当前仍尚有许多问题未达成统一，其中每位患者是否具备有接受NSM治疗的指征尤为关键，而开展NSM术前病例筛选的基本标准即是要求肿瘤未侵犯NAC[19]。在临床实际工作中，NSM治疗多在Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌患者中开展，故本研究所收集的240例病例标本其患者均为Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌，具有临床代表性。

在临床乳腺癌标本的切除处理过程中，NAC病理取材方法主要涉及取材方向、取材深度以及取材间隔和数量等因素，这些因素选择不同的标准是导致最终获得NAC侵犯检出率呈差异的重要原因。就取材方向来看，主要包括依照矢状面与冠状面两种方法取材，临床采用矢状面取材为主，而传统NAC取材通常于乳头正中矢状面取1块。有学者研究发现，乳腺癌侵犯NAC并非完全呈中心性特征，因此于乳头正中矢状面取材可造成假阴性率严重偏高[20]。就取材深度来看，各研究也存在较大差异，从3～20 mm不等。侵犯较轻者若取材过浅也可能导致假阴性率升高；NAC定义为乳头与乳晕及其下方10 mm之内的乳腺组织，故取材过深，甚至达到RUSBY[4]报道的20 mm，则可能导致假阳性率升高。在其研究中，NAC侵犯率达到24.6%。在本研究纳入的对照文献中处于较高水平，不排除有假阳性样本的可能。就取材间隔及数量来看，参考复旦大学附属肿瘤医院病理科所采用的取材方法：垂直于乳腺表面沿矢状面每隔3～5 mm将NAC多切面切开，再于最大矢状面选择性取材1、2块。在本研究中，笔者考虑到实际临床操作时，为预防NAC在术后发生缺血坏死往往于基底多保留5～10 mm，这也比较符合NAC的解剖结构，故本研究在取材时选取乳头与乳晕皮肤以及连同皮下10 mm的整块组织更具临床参考意义。另外采用本院自创5刀法，提示该取材方法通过缩小取材间隔并适当增加样本获取量，可实现更全面且多点位掌握NAC受侵犯情况，避免传统取材造成的漏诊或误诊；同时基于取材深度与NAC解剖结构的贴合，其结果也更具客观性与准确性。

乳腺癌在其早期即可发生微小转移，因此在该阶段内及时发现这些微侵犯灶对指导临床开展乳腺癌治疗具有特殊意义。细胞角蛋白（cytokerantin, CK）是一种分布于外胚层起源细胞中的中间纤维丝，为细胞骨架的组分之一。研究认为[21]，在细胞转化过程中CK所具有的亚微结构及免疫学特性一般不会改变，故检测其类型有助于判断肿瘤组织学来源。本研究所选择的目标蛋白CK-19正常情况下在上皮性肿瘤（如乳腺癌、胃肠癌及肺癌等）组织中稳定表达，但在外周血、淋巴结、皮肤以及NAC中不表达[22]。也就是说，在NAC中找到CK-19阳性细胞即可被认定为已经发生转移的乳腺肿瘤细胞。自上世纪90年代以来，CK-19即被广泛应用于包括乳腺癌在内的多种恶性肿瘤微转移的检测，并呈高敏感性与特异性。本研究20例已证实为乳腺癌的组织样本均为阳性，20例已证实为乳腺腺病的组织样本均为阴性，进一步验证将CK-19作为目标蛋白的可行性。

综上所述，本研究采用的乳头矢状面5刀法取材是一种更客观更全面的取材方法。选择CK-19为目标蛋白并行IHC处理有助于发现NAC的微侵犯灶，将以上取材方法及检测方法联合运用所获得的乳腺癌侵犯NAC检出率可更准确地反应乳腺癌NAC受累的真实情况，具有临床指导意义。

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