依达拉奉对矽肺大鼠的干预治疗作用研究*

肖漪，彭子荷，孙悦，刘嘉祺，王路，郭灵丽，郝小惠，刘和亮，王宏丽（华北理工大学 .医学实验研究中心，.公共卫生学院，河北 唐山063000）

依达拉奉是一种自由基清除剂，临床上，依达拉奉主要用于神经系统疾病，对急性脑梗死、脑出血等疾病显示出了良好的脑保护作用，由于其治疗谱广，近年来已经将其扩展到心脏、肝脏或胃肠道等疾病的治疗[1]。矽肺又称硅肺，是由于长期吸入大量游离二氧化硅粉尘所引起的以肺部广泛的结节性纤维化为主的疾病[2]。有文献报道自由基损伤可能是矽肺发病的一个重要环节[5-6]，因此本研究拟观察依达拉奉对矽肺大鼠的治疗作用及对自由基的影响，以期为临床应用提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

健康无特定病原体级（SPF）级雄性Wistar大鼠54只，体重180～220 g。二氧化硅（SiO2）粉尘（由河北省煤矿卫生与安全重点实验室提供，纯度99%，粒子直径在0.5～10.0 μm，经研磨、烘烤后，用生理盐水配成50 mg/ml浓度粉尘悬液，高压灭菌后，4℃储存备用），还原型谷胱甘肽（glutathione,GSH），羟脯氨酸（hydroxyproline, HYP）及丙二醛（malondialdehyde, MDA）试剂盒（购自南京建成生物工程研究所），兔抗GAPDH（购自于美国Cell Signaling公司），兔抗TGF-β（购于英国Abcam公司），依达拉奉[购自辉南长龙生化药业股份公司（国药准字号 ：H20080592）]。

1.2 方法

1.2.1 分组造模与标本制备 将54只大鼠称重、编号，随机分为3组：对照组、模型组及依达拉奉干预组，对照组6只，模型组和依达拉奉干预组各24只。适应性饲养1周后，模型组和依达拉奉干预组大鼠采用非暴露法气管内一次性注射SiO2悬液（250 mg/kg）复制矽肺模型[3-4]，依达拉奉干预组在注射SiO2悬液第2天后开始腹腔注射依达拉奉4 ml/（kg·d）。对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水，连续28 d。模型与依达拉奉干预组大鼠分别在7、14、21及28 d后处死，取右肺下叶组织进行HE染色，左肺组织用于GSH和转化生长因子β（transform growth factor -beta, TGF-β）含量测定，右肺上叶组织用于HYP测定，右肺中叶用于MDA测定。

1.2.2 肺组织中HYP、GSH、MDA含量测定 样品制备后严格按照试剂盒说明书进行测定。HYP（μg/mg）=（测定管吸光度值-空白管吸光度值）/（标准管吸光度值-空白管吸光度值）×标准品含量 （5 μg/ml）×水解液总体积（10 ml）/组织湿重（50 mg）。

1.2.3 Wester n blot检测肺组织TGF-β蛋白表达腹腔注射28 d后，取各组大鼠肺组织，经蛋白裂解液裂解组织后提取组织总蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法进行蛋白质浓度测定，取30 μg总蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）约1.5 h，转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脱脂奶粉封闭，4℃过夜，TBST清洗，抗兔单克隆抗体anti-TGF-β（1∶1 200），室温摇床孵育4 h，稀释辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1 000），37℃孵育2 h，电化学发光（ECL）显色后用扫描仪进行扫描，经Alpha View自动图像分析系统进行图像采集和定量分析Tgf-β蛋白的表达，同时以内参GAPDH（1∶2 000）进行对照。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 16.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织形态学观察结果

光镜下观察，可见对照组大鼠肺组织结构清晰，肺泡腔内未见炎症细胞，肺泡间隔正常；模型组大鼠染尘后7 d出现如肺泡壁水肿，炎症细胞浸润，肺泡间隔增宽增厚，弥漫性胶原纤维沉积等病理改变；随时间增加，组织结构破坏程度更为严重，证实大鼠矽肺模型复制成功。依达拉奉干预组病变特征与模型组相似，但肺组织胶原沉积减少，肺泡结构基本存在，尤其是在给药21 d后改善较明显。见图1。

2.2 肺组织HYP、GSH和MDA含量变化

对9组HYP、GSH和MDA的比较行方差分析，差异有统计学意义（F=88.190、59.102及17.135，均P=0.000）。模型组和依达拉奉干预组的HYP、GSH与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），依达拉奉干预组HYP、GSH含量与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。同样与对照组比较，模型组MDA增高（P＜0.05），而依达拉奉干预组先升高后降低，21 d后与对照组比较，差异无统计学意义，同时各时间MDA含量均低于模型组（P＜0.05）。见表1。

2.3 肺组织TGF-β蛋白表达

Western blot检测结果（见图2和表2）显示，对9组TGF-β进行方差分析，差异有统计学意义（F=49.766，P=0.000）。模型组和依达拉奉干预组大鼠肺组织中TGF-β蛋白表达量均高于对照组（P＜0.05），而依达拉奉干预组各时间比模型组TGF-β 蛋白表达降低（P＜0.05）。

图1 各组大鼠肺组织形态学变化 （HE×200）

表1 大鼠不同时间段肺组织HYP、GSH和MDA的含量变化 （±s）

表1 大鼠不同时间段肺组织HYP、GSH和MDA的含量变化 （±s）

注：1）与对照组比较，P ＜0.05；2）与模型组比较，P ＜0.05

组别 例数 HYP/（μg/mg） GSH/u MDA/（nmol/mg prot）对照组 6 0.498±0.058 5.436±0.981 0.461±0.234模型组7 d 6 0.914±0.1041） 1.519±0.2081） 2.736±0.6361）14 d 6 1.060±0.1151） 1.844±0.2841） 2.256±0.3261）21 d 6 1.533±0.1701） 1.486±0.4241） 2.038±0.5531）28 d 6 1.889±0.1461） 1.663±0.3451） 1.752±0.2161）依达拉奉干预组7 d 6 0.681±0.1401）2） 2.222±0.1271）2） 1.798±0.4881）2）14 d 6 0.825±0.0481）2） 3.273±0.4211）2） 1.295±0.3511）2）21 d 6 0.845±0.1021）2） 3.685±0.4631）2） 0.926±0.3572）28 d 6 0.921±0.0711）2） 4.550±0.3701）2） 0.871±0.4062）

图2 肺组织TGF-β蛋白表达

表2 肺组织TGF-β蛋白表达比较 （±s）

表2 肺组织TGF-β蛋白表达比较 （±s）

注：1）与对照组比较，P ＜0.05;2）与模型组比较，P ＜0.05

组别 例数 TGF-β对照组 6 0.360±0.167模型组7 d 6 2.824±0.2321）14 d 6 4.240±0.4601）21 d 6 3.733±0.6291）28 d 6 3.254±0.5551）依达拉奉组7 d 6 1.328±0.0811）2）14 d 6 1.686±0.7401）2）21 d 6 1.583±0.3781）2）28 d 6 1.218±0.4131）2）

3 讨论

近年来的研究证实，自由基在SiO2引起的肺纤维化方面起着关键性的作用[7]。石英等颗粒在粉碎过程中自身可产生自由基，当肺巨噬细胞（alveolar macrophage, AM）吞噬石英和游走时引起呼吸爆发可产生大量自由基，髓单核细胞在肺中转化为AM后被活化时还可产生氮氧自由基，导致氧化和抗氧化系统失衡。自由基作用于AM，产生脂质过氧化导致质膜损伤，进而分泌多种细胞因子，诱导纤维细胞增生和胶原合成，造成肺纤维化。自由基还可以作用于肺内其他生物基质和对免疫功能发生影响，促进肺纤维化过程[8]。

依达拉奉是目前广泛被认可的自由基清除剂[9]，于2001年4月在日本首次上市。有相关研究显示，其对自由基毒性损伤具有强大的抑制作用[10-11]。本研究探索应用依达拉奉治疗矽肺大鼠，结果发现应用依达拉奉后矽肺大鼠体内反映自由基生成程度的MDA降低，而反映体内抗氧化系统的重要因子GSH活力提高[12]，提示依达拉奉在矽肺发病过程中起到抗自由基作用。

在矽肺纤维化过程中，TGF-β是其中最重要的促纤维化因子[13]。本研究结果显示，随着时间的进展，模型组TGF-β蛋白含量先增高后降低，符合相关文献中的趋势[14]；HYP能反映胶原增加及胶原代谢的状况[15]，测定肺组织中HYP的水平，可直接反映肺成纤维细胞合成胶原的能力。本研究结果发现，应用依达拉奉后TGF-β和HYP相对矽肺模型组减少，提示依达拉奉可以有效降低矽肺纤维化程度。

综上所述，依达拉奉可有效降低矽肺大鼠体内的自由基水平，同时可使自身的抗氧化系统得到一定的恢复，因而降低矽肺纤维化程度，使矽肺大鼠的症状得到改善从而起到治疗作用。但其降低自由基水平干预矽肺纤维化进程的具体机制还需要进一步探讨。

[1]ZHAO H Q. Protective effect of edaravone on corneal nerve of rats with experimental diabetic corneal neuropathy[D]. Chongqing:ChongQing Medical University, 2012.

[2]LI D H, HE F S. Pneumoconiosis[M]. Beijing: Chemical Industry Press, 2010: 1-202.

[3]PENG H B, CHU J X, CAO F Y, et al. Antioxidation effect of ursolic acid on early silicosis in rats[J]. J Environ Occup Med,2015, 32(5): 476-480.

[4]TIAN L Y, YU W C. The therapeutic study of edaravone and NAC on rats fibrosis induced by bleomycin[C]. The 14th National Conference on Breathing Epidemiology, 2013: 227-228.

[5]XIA S N. The research advance of pathogenesis of silicosis[J].China Foreign Medical Treatment, 2009, 10(2): 167-168.

[6]LI YIN, LIU X L, LIU X C. Role of free radical in pathogenesis of silicosis[J]. Occup Health & Emerg Rescue, 2005, 23(1): 35-37.

[7]GAO Y X, WANG R. Mechanism of pulmonary fibrosis due to silica and role of cytokine in silicotic fibrosis[J]. Chinese J Ind Med, 2008, 21(1): 31-33.

[8]BRINGARDNER B D, BARAN C P, EUBANK T D, et al. The role of inflammation in the pathogenesis of idiopathic pulmonary fi brosise[J]. Antioxid Redox Signal, 2008, 10(2): 287-301.

[9]WATANABE T, TAHARA M, TODO S. The novel antiox-idant edaravone： from bench to bedside[J]. Cardio-vasc Ther, 2008,26(2): 101-114.

[10]KIYOSHI KIKUCHI, SALUNYA TANCHAROEN, et al. The efficacy of Edaravone (Radicut), a free radical scavenger, for cardiovascular disease[J]. Int J Mol Sci, 2013, 14(7): 13909-13904.

[11]KIKUCHI K, TANCHAROEN S, MATSUDA F, et al. Edaravone attenuates cerebral ischemic injury by suppressing aquaporin-4[J].Biochemical and Biophysical Research Communications, 2009,390(4): 1121-1125.

[12]S OKTAY, B ALEV, et al. Edaravone ameliorates the adverse effects of valproic acid toxicity in small intestine[J]. Human and Experimental Toxicology, 2015, 34(6): 654-661.

[13]HU Y B, ZENG Q F. Research progress of cellular and molecular mechanisms in silicosis fibrosis[J]. Chin J Ind Hyg Occup Dis,2003, 21(3): 219-221.

[14]HAO C F, YAO W, WU Y M. Expression of TGF-β1 in lung of experimental pneumoconiosis in rats[J]. Journal of Medical Forum, 2007, 27(7): 42-43.

[15]PENG H B, WANG J X, LIU Y, et al. Effect of oleanolic acid on expression of TNF-α and collagen in silicotic rats in vivo[J].Chinese Journal of Pathophysiology, 2015, 31(6): 1081-1086.