胰腺癌组织中Plexin-B1、Gli1蛋白表达及其与临床特征的关系

周海萍 沈忠磊

胰腺癌是临床上高发的恶性消化道肿瘤之一。近年来随着饮食结构的改变，胰腺癌发病率呈逐年上升趋势，严重影响着人们的健康[1-3]。有学者对胰腺癌分子发病机制进行研究，发现在正常情况下，Hedgehog（HH）信号通路是哺乳动物胚胎发育、器官形成和干细胞维持的重要基础，但其非正常激活可能与多种癌症的发生密切相关，脑胶质瘤相关癌基因-1（Gli1）被认为是HH信号通路活化的指标，且在多种肿瘤组织中表达升高[4-6]。胰腺癌具有嗜神经的特点，Sema4D是一种免疫信号素，参与神经的生长发育过程，同时在免疫和血液系统中发挥作用；从蛋白B1（Plexin-B1）作为其受体，两者结合可参与细胞侵袭、生长以及迁徙，与胰腺癌的发生、发展有着密切联系[7-9]。因此，本文就胰腺癌组织中Plexin-B1、Gli1蛋白表达及其与临床特征的关系作一探讨，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 收集本院2013年1月至2016年5月经手术后病理学证实的胰腺癌组织标本69份，69例胰腺癌患者中男 36 例，女 33 例；年龄 41～77（58.3±12.6）岁；临床分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期29例，Ⅲ期29例；组织分化程度：高分化19例，中分化24例，低分化26例；伴有淋巴结转移37例。为进行对照研究，又在2016年5至12月手术切除的34例胰腺癌组织标本中切取了距胰腺癌组织3cm以外的正常胰腺组织标本34份。纳入标准：（1）患者术前未接受放化疗、免疫治疗；（2）各项资料完整。排除合并其他部位肿瘤、既往有放化疗史的患者。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化染色 将标本组织作厚4μm的连续切片，石蜡包埋，常规脱蜡至水，切片浸入50mmol/L乙二胺四乙酸溶液（pH 8.0）中。用微波抗原修复10min，冷却至室温，充分水洗，PBS浸洗。滴加正常山羊血清封闭液，室温维持20min。去掉多余液体，加入Plexin-B1、Gli1多抗或单抗，维持4℃过夜，PBS浸洗。加入SP 9 000通用型生物素标记二抗，37℃维持40min；用二氨基联苯胺（DAB）显色30s，再用苏木素复染，最后用系列乙醇脱水及透明，用中性树胶封固，在光学显微镜下观察。

1.2.2 结果判断标准 Plexin-B1蛋白主要表达于细胞核和细胞质，Gli1蛋白主要表达于细胞质和细胞膜，均呈黄色、棕黄色、褐色表达。（1）着色强度：无色为0分，淡黄色为色1分，棕黄色为2分，褐色为3分；（2）阳性细胞所占比例：≤10%为1分，＞10%～50%为2分，＞50%～75%为3分，＞75%为4分；以上2种得分相乘所得总分＜3分为阴性，≥3分为阳性；＜3分为“-”；3～5分为“+”，6～9 分为“++”，＞9 分为“+++”。

1.3 统计学处理 应用SPSS 16.0统计软件。计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；胰腺癌组织中Plexin-B1与Gli1蛋白表达的相关性分析采用Spearman秩相关。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种组织标本中Plexin-B1、Gli1蛋白表达比较胰腺癌组织Plexin-B1、Gli1蛋白表达阳性率分别为72.46%（50/69）、53.62%（37/69），均高于正常胰腺组织的 20.59%（7/34）、26.47%（9/34），差异均有统计学意义（χ2=24.80、6.79，均P＜0.05），见表1。

表1 两种组织标本中Gli1蛋白表达水平比较（例）

2.2 69例胰腺癌患者Plexin-B1、Gli1蛋白表达与临床特征的关系 不同临床分期、肿瘤直径、是否淋巴结转移的患者胰腺癌组织中Plexin-B1、Gli1蛋白表达比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；不同年龄、肿瘤部位、组织分化程度的患者胰腺癌组织中Plexin-B1、Gli1蛋白表达比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2。

表2 69例胰腺癌患者Plexin-B1、Gli1蛋白表达与临床特征的关系[例（%）]

2.3 胰腺癌组织中Plexin-B1与Gli1蛋白表达的相关性 胰腺癌组织中Plexin-B1与Gli1蛋白表达呈正相关（rs=0.885，P＜0.05），见表3。

表3 69份胰腺癌组织中Plexin-B1与Gli1蛋白表达的相关性（例）

3 讨论

胰腺癌初期症状往往不明显，早期诊断较为困难。等到患者就诊时，往往已发生了转移或侵犯了重要血管，故而无法采用根治性手术进行治疗。在诸多治疗方法中，手术切除是效果较好的方法。但因胰腺癌的神经和淋巴转移特性，易造成术后短期肿瘤复发、预后较差。因此，早发现、早治疗是治愈胰腺癌的关键[10-11]。胰腺癌具有嗜神经性，神经浸润会导致疼痛；此外，还会导致癌细胞转移。神经周围浸润（PNI）是胰腺癌的一种复发方式，主要指肿瘤细胞局部浸润进入神经周围的间隙或穿破神经外膜沿着神经束膜浸润的一种现象。Sema4D是一种免疫信号素，属于轴突生长导向因子中的跨膜分子的Semaphorin家族的一员，参与神经的生长发育过程，同时也在免疫系统和血液系统中发挥着作用。Sema4D高亲和作用受体为Plexin-B1，两者的结合可磷酸化Met下游的某些信号分子，从而参与细胞侵袭、生长以及迁徙，与胰腺癌的发生、发展有着密切关系。有文献报道Plexin-B1蛋白在胰腺癌组织中高表达[12-13]。HH信号通路正常激活，是哺乳动物胚胎发育、器官形成和干细胞维持的重要基础，而非正常激活可能与多种癌症的发生密切相关。基因定位于人类12号染色体的Gli1蛋白是HH信号通路的终末，也是其重要的转录激活因子，Gli1蛋白表达升高会激活目的基因的转录。通过调控HH信号通路目的基因的转录，以调节肿瘤细胞增殖、分化及转移等多种分子的基因转录水平，进而影响肿瘤的发生、发展，被认为是HH信号通路活化的指标[14-15]。

本研究比较胰腺癌组织与癌旁正常组织中Plexin-B1、Gli1蛋白表达，发现胰腺癌组织中两种蛋白表达阳性率均明显高于癌旁正常组织；间接说明胰腺癌的发生与Plexin-B1、Gli1蛋白表达密切相关。为深入研究Plexin-B1、Gli1蛋白表达与胰腺癌发生、发展的关系，本文探讨了两者与胰腺癌患者临床特征的关系，结果表明胰腺癌组织中Plexin-B1、Gli1蛋白表达与临床分期、肿瘤直径、淋巴结转移等有关，进一步说明Plexin-B1、Gli1可能参与了胰腺癌发生、发展的全过程。因此，临床上可以应用Plexin-B1、Gli1作为早期诊断胰腺癌的肿瘤标识物，且有望成为治疗胰腺癌的新分子靶点。由于胰腺癌早期症状不明显，因此早期诊断较为困难，仅采用一种肿瘤标识物的确诊率往往较低，故本研究探讨了胰腺癌组织中Plexin-B1与Gli1蛋白表达的相关性，发现两者呈正相关；这表明Plexin-B1、Gli1有望成为早期诊断胰腺癌的联合肿瘤标识物，以提高临床确诊率。

综上所述，胰腺癌组织中Plexin-B1、Gli1蛋白表达阳性率明显升高，与患者的临床分期、肿瘤直径、淋巴结转移等有关。Plexin-B1、Gli1有望成为早期诊断胰腺癌的肿瘤标识物，且两者联合诊断可提高确诊率。

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