川崎病患儿治疗前后外周血单核细胞P22phox表达的变化及其临床意义

邓斌， 黄宇， 赵凌， 皮光环

川崎病是一种病因不明，以全身弥漫性血管炎为主要病变的急性发热出疹性疾病[1]。病理学证实，单核/巨噬细胞在川崎病急性期渗入冠状动脉壁内外的炎症细胞中占主导地位，受炎性细胞因子激活而进一步迁移、浸润，并引起一系列反应，包括活性氧的产生[2]。研究发现，氧化应激在伴有冠脉瘤的川崎病患者中增加，并且与动脉内膜中层增厚和硬化相关[3]。P22phox作为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶重要的亚单位，与其激活密切相关。P22phox活性的改变可影响体内活性氧的产生，在氧化应激所致的炎症中起着重要作用[4]。本研究采用RT-PCR技术初步观察川崎病患儿治疗前后和正常儿童外周血单核细胞中P22phox的变化及其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2015年10月至2016年6月川北医学院附属医院儿科收治住院的川崎病患儿40例，其中男24例，女16例；年龄0.5～6.5岁，平均年龄(2.75±1.04)岁；有冠脉损害者15例，无冠脉损害者25例。同期选择本院小儿外科择期手术患儿20例为正常组，其中男13例，女7例；年龄1.2～8.5岁，平均年龄(3.48±1.42)岁。两组患儿在性别、年龄方面比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 诊断标准 参照2009年中华医学会儿科学分会制定的川崎病诊断标准[5]。川崎病合并冠状动脉病变的超声诊断标准为[6]：(1)冠状动脉扩张的诊断标准：<3岁>2.5 mm，3～9岁>3 mm，>9～14岁>3.5 mm。(2)冠状动脉瘤的诊断标准：冠状动脉扩张内径大于正常1.5倍。小冠脉瘤：局部冠脉扩张内径<4 mm。中等冠脉瘤：冠脉管腔内径4～8 mm，或≥5岁儿童，冠脉管腔内径介于正常冠脉内径的1.5～4倍。巨大冠脉瘤：冠脉管腔内径>8 mm，或≥5岁儿童冠脉管腔内径大于正常冠脉内径的4倍。

1.3 川崎病的治疗 (1)人免疫球蛋白治疗：于起病发热的第7天，使用国际推荐人免疫球蛋白单次剂量2 g/kg，10～12 h内静脉输入。(2)阿司匹林口服：采用日本推荐中等剂量即30～50 mg/(kg·d)，分2～3次，热退3 d后逐渐减量，14 d后减至3～5 mg/(kg·d)，1个月后复查血常规、肝功、血沉、C反应蛋白及超声心动图，无异常者于发病后8～12周停药，有冠脉病变者，需服用至冠状动脉内径恢复正常。

1.4 标本收集 分别收集川崎病患儿入院当天(发热4～5 d，人免疫球蛋白治疗前)、人免疫球蛋白治疗3 d后和非感染对照组儿童静脉血3 mL，置肝素抗凝管，2 000 r/min×10 min离心，吸取上层血浆置于-80 ℃冰箱冻存备检。剩余加入等体积无菌磷酸盐缓冲液，混匀后用淋巴细胞分离液(购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)密度梯度离心后分离外周血单核细胞。

1.5 外周血单核细胞中P22phox mRNA表达的检测 采用TRIzol(天根生化科技有限公司)一步提取外周血单核细胞中的RNA，应用紫外分光光度仪(GENEQUANT,UK)测定细胞总RNA的浓度和纯度。

1.6 反转录合成cDNA 参照PrimeScriptTMRT reagent Kit说明书(TaKaRa公司，日本)，将10 μL已经去除基因组的反应液也加入10 μL反转率反应液中，总反应体系为20 μL，42 ℃ 15 min合成cDNA，作为PCR 反应的模板，于-20 ℃保存。

1.7 实时荧光定量PCR反应 使用SYBR Premix Ex Tap Ⅱ荧光染料和荧光定量PCR仪进行扩增。P22phox引物及内参序列由上海生物工程有限公司设计并合成。P22phox引物序列：上游：5′-CGA GCG GCA TCT ACC TAC TG-3′；下游：5′-GCT TGA TGG TGC CTC CGA T-3′；产物长度为99 bp。内参GAPDH序列：上游：5′-CTG GGC TAC ACT GAG CAC C-3′；下游：5′-AAG TGG TCG TTG AGG GCA ATG-3′；产物长度101 bp。反应体系为SYBR Premix Ex Tap Ⅱ 10 μL；P22phox引物各0.5 μL；GAPDH各0.5 μL；ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL；cDNA 2 μL；ddH2O 6.6 μL；总计20 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，共40个循环。

1.8 扩增曲线 所有基因在循环数内达到平台期，说明扩增良好；融解曲线:单峰说明产物特异性好。

2 结果

2.1 定量结果 P22phox及GAPDH基因扩增曲线起峰良好，基线稳定。溶解曲线均呈单峰，无杂峰，说明无非特异性扩增产物产生，定量结果符合实验要求，见图1(封三)。

2.2 川崎病患儿外周血单核细胞P22phox mRNA表达分析 川崎病组治疗前后P22phox mRNA的表达比较差异有统计学意义(P<0.05)；川崎病组治疗前与正常组P22phox mRNA的表达比较差异有统计学意义(P<0.01)；川崎病组治疗后与正常组P22phox mRNA的表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 川崎病组治疗前后及正常组P22phox mRNA表达的比较

注：与治疗前比较，at=2.510，P<0.05；与正常组比较，bt=5.058，P<0.01。

2.3 治疗前CALs、NCALs，治疗前后CALs，治疗后CALs、NCALs，治疗前后NCALs各组P22phox mRNA表达分析 治疗前CALs、NCALs P22phox mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)；治疗前后CALs P22phox mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后CALs与NCALs P22phox mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)；治疗前后NCALs P22phox mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图2(封三)。

3 讨论

研究表明，氧化应激参与川崎病急性期血管炎的发生，血管内皮功能障碍及氧化应激与后期的冠状动脉粥样硬化密切相关[7]。细胞色素b245(P22phox)是一种广泛存在的蛋白质，由位于染色体16q24上的CYBA基因编码。作为烟酰胺脱氢酶/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的一个亚单位，P22phox在传递电子及产生超氧阴离子方面起重要作用。其表达增加时NADPH氧化酶活性增加，进而增加体内活性氧水平，导致氧化还原信号改变，引起一系列功能紊乱。研究显示，氧化应激过程中产生的活性氧会损伤DNA，引起血管内皮细胞损伤，导致血管功能障碍[8]。以往研究显示，血管内皮损伤、血管弹力蛋白与血管壁结构蛋白酶的降解、负向调节T细胞活化可能与川崎病患儿冠脉损伤发生机制相关。成纤维细胞生长因子23、中性粒细胞表面黏附分子、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α等因子异常表达，核因子κB途径等细胞内信号传导通路的异常均可导致血管内皮的免疫性损伤。

本研究结果表明，川崎病急性期治疗前外周血单核细胞P22phox mRNA表达显著高于治疗后及正常组的表达，而治疗后与正常组表达无差异，治疗前有冠脉损害和无冠脉损害P22phox mRNA表达无差异，表明急性期外周血单核细胞P22phox mRNA存在高表达情况，提示氧化应激可能参与川崎病急性期的发病机制。阿司匹林及人免疫球蛋白治疗可使外周血单核细胞P22phox mRNA表达降低。川崎病急性期P22phox mRNA表达升高的机制目前尚不明确，国外学者研究表明核因子κB、白细胞介素1β均可上调P22phox的表达[9-10]，Yin等[11]研究发现川崎病患儿外周血单核细胞核因子κB活性显著升高，是否急性期外周血单核细胞P22phox mRNA的高表达与核因子κB活性升高有关，亦或核因子κB是通过上调P22phox的表达而导致血管内皮的免疫性损伤有待更进一步的研究。研究显示，阿司匹林可抑制环氧合酶1、环氧合酶2，进而抑制血小板活化和炎症反应，可通过减轻氧化性低密度脂蛋白介导的损伤及增加内皮细胞铁蛋白表达而起抗氧化作用，可通过调节一氧化氮合成来改善血管舒缩活性，可通过抑制核因子κB的活化而在转录水平调控多种促炎因子的表达[12]。人免疫球蛋白能够封闭单核/巨噬细胞壁上的FC受体，下调核因子κB活性，抑制单核细胞产生细胞因子。因此推测阿司匹林及人免疫球蛋白可能是通过下调核因子κB活性导致P22phox下调，进一步抑制活性氧的产生，是否阿司匹林及人免疫球蛋白还可通过影响其他P22phox调节因素来下调P22phox mRNA的表达有待进一步研究。

值得关注的是，虽然整体上治疗前外周血单核细胞P22phox mRNA表达高于治疗后，但我们也发现40例川崎病患儿(15例冠脉损害，25例正常)中有9例患儿(4例冠脉损害，5例正常)的P22phox mRNA表达治疗后高于治疗前。众所周知，阿司匹林及人免疫球蛋白治疗后仍有少许患儿并发冠脉损害，国外研究显示有川崎病病史的成年冠脉粥样硬化患者存在全身性血管内皮细胞功能障碍及氧化应激，认为血管内皮细胞功能障碍及氧化应激是川崎病患者冠脉粥样硬化早期发病的危险因素之一[7]。P22phox编码基因CYBA具有多态性，研究发现C242T、A640G、A930G基因多态性与氧化应激所导致的心血管疾病相关[13-15]，是否本实验中出现的治疗后P22phox mRNA表达升高是实验误差还是上述情况的可能机制有待于样本量的进一步扩大以及对恢复期患儿的随访研究。

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