冬凌草甲素生物合成途径及关键酶的研究进展

徐会敏, 高登风, 魏闪闪, 史胜利, 苏成福

(1.河南中医药大学 基础医学院，郑州 450008； 2.河南中医药大学 药学院，郑州 450008)

冬凌草是唇形科香茶菜属植物碎米桠[Isodonrubescens(Hemsl.) Hara]，为多年生草本或亚灌木植物，也是一种重要的药用植物，主产于河南省，国内其他省份也均有分布[1-2]。

冬凌草全株入药，具有抗癌、抗菌消炎[3-4]、清热解毒、活血止痛等功效。冬凌草含有萜类、黄酮类、生物碱等多种活性成分[5]。其中，甲素是冬凌草的主要药用成分，属于对映-贝壳杉烷类二萜化合物[6-8]，具有重要的医药价值和经济价值。

二萜类化合物是植物体内重要的次生代谢物，由4个异戊二烯基单元组成，含有20 个碳原子的一类天然化合物，广泛存在于植物、微生物等生物体内[9-10]。二萜类化合物的化学结构多变、来源丰富决定了其生物活性的多样，也使得其成为药学研究领域的热点[11]。

1 二萜类化合物生物合成途径

目前，已知二萜类化合物的生物体合成途径有两条：甲羟戊酸途径(Mevalonic acid，MVA)和5-磷酸脱氧木酮糖途径(Methyl-D-erythritol phosphate，MEP)[12]，如图1所示。在甲羟戊酸途径中，以乙酰CoA为原料合成甲羟戊酸(MVA)，再经多步酶促反应合成异戊烯基焦磷酸(IPP)。参与此过程的酶有乙酰CoA酰基转移酶(AACT)、羟甲基戊二酰CoA合酶(HMGS)、羟甲基戊二酰CoA还原酶(HMGR)、甲羟戊酸激酶(MK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MDD)等[13]。在MEP途径中，丙酮酸与甘油醛-3-磷酸结合形成1-脱氧木酮糖-5-磷酸，再经多步酶促反应合成异戊烯焦磷酸(IPP)及其异构物二甲基丙烯焦磷酸 (DMAPP)。参与此过程的酶有：1-脱氧-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)、1-脱氧-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)、4-二磷酸胞苷-2-甲基-赤藓醇合酶(CMS)、4-二磷酸胞苷-2-甲基-赤藓糖激酶(CMK)、2-甲基-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合成酶(MCS)、1-羟基-2-甲基-2-丁烯基-4-焦磷酸合酶(HDS)、IPP/DMAPP 合酶(IDS)及异戊烯基焦磷酸异构酶(IPI)等[14]。

MVA途径和MEP途径形成的IPP与DMAPP可转化为牻牛儿基焦磷酸(Geranyl pyrophosphate，GPP)，进一步形成二萜骨架或贝壳杉烯化合物[15]，随后细胞色素 P450等多种修饰酶对其结构进行修饰，最终合成冬凌草甲素等二萜类化合物[16]。此过程需要下列酶的参与：牻牛儿基焦磷酸合酶(GPPS)、法尼基焦磷酸合成酶(FPPS)、牻牛儿牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)、柯巴基焦磷酸合酶(CPS)、 贝壳杉烯合酶(KS)，以及细胞色素 P450等多种修饰酶[17]。

植物萜类生物合成分为中间体生成、萜类生成和化学修饰等3个阶段[18]。与之相应，代谢途径中的酶也分为3类。IPP与DMAPP生成前的酶属于I类酶，其中DXS、DXR和 HMGR分别为MEP和MVA途径的关键酶[19](图1)。II类酶主要是各种环化酶，催化IIP和DMAPP生成各种不同分子量大小的形式各异的萜类化合物或中间体，是萜类生物合成的关键酶。III类酶的种类较多，其作用是对环化酶的作用产物进行分子结构修饰，包括异构化、甲基化、脱甲基化、羟基化及加成等过程。目前，萜类合成研究成果主要来自对I类和II类关键酶的研究，对III类酶研究较浅，了解的内容也较少[20]。

2 冬凌草生物合成的关键酶及其编码基因

冬凌草细胞内甲素合成相关酶的表达量低，且有时空差异性，因而其分离纯化较为困难。因此，研究冬凌草二萜类化合物生物合成途径关键酶的编码基因，是揭示甲素生物合成途径的重要方法[21-22]。目前，冬凌草甲素生物合成途径中仅有少数几个I、II类酶的编码基因完成测序及克隆，包括乙酰CoA酰基转移酶(acetyl-CoA acetyltransferase，AACT)、羟甲基戊二酰CoA合酶(HMGS)、1-脱氧-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)和异戊烯基焦磷酸异构酶(IPI)基因等。

2.1 乙酰CoA酰基转移酶(acetyl-CoA acetyltransferase，AACT)

乙酰CoA酰基转移酶属于Ⅱ型硫解酶家族，是植物萜类生物合成 MVA 途径中的首个关键酶，参与细胞中萜类、固醇类等重要代谢过程，不仅参与调节萜类合成代谢，还参与植物逆境胁迫的响应。研究发现，冬凌草AACT基因全长1254 bp，可编码由417 个氨基酸组成的、分子质量约为42 949.6 u的亲水性蛋白质。冬凌草AACT基因片段与丹参AACT的同源性最高，为93%，与番茄、莲、芝麻等双子叶植物AACT的同源性为80%以上，编码硫解酶的4个保守结构域及2个保守位点。该酶蛋白可能主要存在于内质网，也可能分布于过氧化物酶体或微体。冬凌草AACT表达具有组织器官特异性，其转录水平由高到低依次是花、叶片、根、茎、愈伤组织[23]。

图 1 冬凌草甲素的生物合成路径Fig 1 Biosynthesis pathway of oridonin

AACT: Acetyl-CoA acyltransferase; HMGS: Hydroxy methylglutaryl-CoA synthase; HMGR: Hydroxy methylglutaryl-CoA reductase; MK: Mevalonate kinase; PMK: Phosphomevalonate kinase; MDD: Mevalonate disphosphate decarboxylase; DXS: 1-Deoxy-xylulose-5-phosphate synthase; DXR: 1-deoxy-xylulose-5-phosphate reductoisomerase; CMS: 4-Diphosphocytidyl-2-methyl-erythritol synthase; CMK: 4-diphosphocytidyl-2-methyl-erythritol kinase; MCS: 2-methyl-erythritol-2,4-cyclodiphosphate synthase; HDS: 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-pyrophosphate synthase; IDS: IPP/DMAPP synthase; IPI: Isopentenyl pyrophosphate isomerase; GPPS: Geranyl pyrophosphate synthase; FPPS: Farnesyl pyrophosphate synthase; GGPPS: Geranylgeranyl pyrophosphate synthase; CPS: Copalyl pyrophosphate synthase; KS: Kaurene synthase

2.2 羟甲基戊二酰CoA合酶(Hydroxy methylglutaryl-CoA synthase，HMGS)

羟甲基戊二酰CoA合酶催化乙酰乙酰CoA与乙酰CoA 缩合生成羟甲基戊二酰CoA的作用。研究发现，冬凌草HMGS基因全长为1382 bp，编码由460个氨基组成的，分子质量约为50 571.5 u的亲水性蛋白。冬凌草HMGS基因片段与薰衣草的同源性最高,为96%，与蓖麻、芝麻等双子叶植物同源性为80%以上。HMGS蛋白结构域高度保守，具有一个羟甲基戊二酰CoA 合成酶结构域，以及半胱氨酸活性位点。该蛋白主要存在于细胞质中，也可能分布于液泡、线粒体中。冬凌草HMGS蛋白表达量相对较高，检测发现其在组培苗叶中表达量最高，其次是根，花中最低，可能在冬凌草植株合成累积冬凌草甲素中发挥重要的调节作用[24]。

2.3 1-脱氧-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-xylulose-5-phosphate synthase，DXS)

1-脱氧-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)是5-磷酸脱氧木酮糖(MEP)途径的第一个关键酶，催化丙酮酸与3-磷酸-甘油醛缩合生成1-脱氧-木酮糖-5-磷酸，在植物萜类物质的生物合成中发挥重要的作用。冬凌草DXS基因，属于植物DXS II家族，全长2169 bp，编码722个氨基酸，分子质量为77.7 ku。冬凌草DXS蛋白与同科的丹参、薄荷等DXS蛋白序列具有较高的同源性，N端均含一段质体转运肽序列，且均具有一保守焦磷酸硫胺素结构域，以及与吡啶结合相关的DRAG结构域。DXS基因在冬凌草根、叶中表达量较高，而茎、花和愈伤组织中较低[25]。

2.4 1-脱氧-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(1-deoxy-xylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR)

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)催化1-脱氧-木酮糖-5-磷酸生成5-磷酸脱氧木酮糖途径(MEP)，参与类异戊二烯的合成和积累，是MEP途径中最重要的限速酶，也是萜类代谢工程研究的重点。研究发现，冬凌草DXR基因全长1500 bp，编码为亲水性蛋白。DXR蛋白在游离核糖体上合成完成后，被转运到叶绿体中行使功能，不与膜结合。DXR在愈伤组织中的表达量最低，茎中表达量较高[26]。

2.5 异戊烯基焦磷酸异构酶(Isopentenyl pyrophosphate isomerase，IPI)

异戊烯基焦磷酸异构酶(IPI)催化异戊烯焦磷酸(IPP)异构化形成二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)。IPP和DMAPP是萜类化合物合成的重要前体物质，故IPI与萜类合成密切相关。冬凌草IPI基因全长1050 bp，编码由301个氨基酸组成亲水性的非膜蛋白。该酶蛋白上存在多个磷酸化位点，推测通过磷酸化/去磷酸化以调控其活性，使其成为调控下游代谢途径的总开关，直接影响萜类合成的五碳前体库的代谢流向。该酶蛋白在叶中表达量相对较高，在愈伤组织中表达量最低[27]。

2.6 柯巴基焦磷酸酶(Copalyl diphosphate synthase，CPS)

柯巴基焦磷酸酶催化牻牛儿牻牛儿基焦磷酸(Geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP)环化生成柯巴基焦磷酸[28]。研究发现冬凌草有一个柯巴基焦磷酸酶(CPS)基因家族，包括IrCPS1～IrCPS5。IrCPS1、IrCPS2、IrCPS4和IrCPS5均含有CPS典型的(D,E)XDD基序，但IrCPS3中的第二个Asp被Asn替代，其基序转变为(D,E)XND，从而失去催化活性。IrCPS1全长序列与毛萼香茶菜、丹参等物种CPS基因序列的相似性在98%～99%，IrCPS3、IrCPS4和IrCPS5的相似性为99%，而IrCPS2的相似性则小于93%。这些酶催化产物的旋光性不同，IrCPS1、IrCPS2催化生成普通柯巴基焦磷酸，而IrCPS4和IrCPS5则催化生成对映柯巴基焦磷酸。IrCPS1在根部高表达，IrCPS2与IrCPS5在多种组织中均有表达，IrCPS3在所有组织中的表达量都相对较低，而IrCPS4在叶片中高表达，提示IrCPS4在甲素等二萜类化合物的生物合成中可能发挥着更重要的作用[29]。

2.7 类贝壳杉烯合酶(kaurene synthase-like cyclase，KSL)

类贝壳杉烯合酶(KSL)催化柯巴基焦磷酸环化生成贝壳杉烯[30]。冬凌草中发现类贝壳杉烯合酶(KSL)基因家族，包括IrKSL1～ IrKSL6。与毛萼香茶菜、丹参等物种的KSL基因序列比较，IrKSL1和IrKSL3全长序列的相似性在98%～99%，IrKSL6的相似性为99%，而IrKSL2、IrKSL4和IrKSL5的相似性则小于93%。IrKSL1、IrKSL3和IrKSL6为单起源基因，IrKSL3和IrKSL6含γ、β、α 3个结构域，但IrKSL1无N端的γ结构域，仅有β、α结构域。IrKSL1在根部高表达，IrKSL5和IrKSL6在多种组织均有表达，IrKSL2、IrKSL3和IrKSL4在叶片中高表达。IrKSL2、IrKSL4和IrKSL5催化对映柯巴基焦磷酸发生反应，其中IrKSL4可能在甲素合成中起重要作用[29]。

2.8 细胞色素P450 (Cytochrome P450 enzymes，CYP)

细胞色素P450单加氧酶系在二萜类化合物的生物合成中发挥着重要的作用。冬凌草中发现CYP76AH30，其序列与CYP76AH1[31]有80.5%相似性，与CYP76AH22-24的相似性为76.1%～ 77.6%。通过酵母菌转化实验，发现CYP76AH30编码Ferruginol合成酶，催化Miltiradiene生成Ferruginol[29]。

3 总结与展望

当前，对冬凌草甲素生物合成途径的研究主要集中在I类酶上，对II类酶和III类酶研究很少，需要深入研究，将来应深入挖掘与冬凌草甲素合成关键酶及其基因，进一步完善其生物合成途径[32]。通过研究MVA /MEP 途径的相互联系，明确两条途径的调控机制，以及基因时空差异表达调控机制，以实现对合成途径中调控因子，包括正反作用元件的分离、鉴定与合理应用，以及基因的协同转化，通过基因工程技术实现冬凌草甲素的大规模生产[33]。

[1]LI D，HAN T，LIAO J，et al.Oridonin, a promising ent-kaurane diterpenoid lead compound[J].Int J Mol Sci，2016，17(9):1395.

[2]LIU M Q，LIU J F.Structure and histochemistry of the glandular trichomes on the leaves ofIsodonrubescens[J].African Journal of Biotechnology，2012，11(17) :4069-4078.

[3]LIU Z，OUYANG L，PENG H，et al.Oridonin: targeting programmed cell death pathways as an anti-tumour agent[J].Cell Prolif，2012，45(6): 499-507.

[4]IKEZOE T，YANG Y，BANDOBASHI K，et al.Oridonin, a diterpenoid purified fromRabdosiarubescens，inhibits the proliferation of cells from lymphoid malignancies in association with blockade of the NF-κB signal pathways[J].Mol Cancer Ther，2005，4(4):578-586.

[5]ZHANG M，ZHANG Y，LU W，et al.Synthesis and revision of stereochemistry of rubescensin S[J].Org Biomol Chem，2011，9(12): 4436-4439.

[6]LI D，HAN T，XU S，et al.Antitumor and antibacterial derivatives of oridonin: a main composition of dong-ling-cao[J].Molecules，2016，21(5):E575.

[7]ZHU L L，HONG R.Biomimetic cationic cyclization toward ent-kaurene-type diterpenoids[J].Chin J Chem，2013，31(1):111-118.

[8]WU H Y，ZHAN R，WANG W G，et al.Cytotoxic ent-kaurane diterpenoids fromIsodonwikstroemioides[J].J Nat Prod，2014，77(4):931-941.

[9]YANG L，YANG C，LI C，et al.Recent advances in biosynthesis of bioactive compounds in traditional Chinese medicinal plants[J].Sci Bull(Beijing)，2016, 61:3-17.

[10]吴亦晴，虞劲祥，程志红.二萜类化合物微生物转化研究进展[J].中国生化药物杂志，2016, 36(3):9-15.

[11]IRMISCH S，MÜLLER A T，SCHMIDT L，et al.One amino acid makes the difference: the formation of ent-kaurene and 16α-hydroxyent-kaurane by diterpene synthases in poplar[J].BMC Plant Biology，2015,15:262.

[12]王秋军，张 犇，王剑文.药用植物类异戊二烯代谢途径及其活性产物合成调控研究进展[J].植物学研究，2012, 1:23-29.

[13]刘雨佳，张夏楠，程琪庆，等.药用植物萜类生物合成HMGR基因研究进展[J].中国中药杂志，2013, 38(19): 3226-3233.

[14]ZERBE P，HAMBERGER B，YUEN M M，et al.Gene discovery of modular diterpene metabolism in nonmodel systems[J].Plant Physiology，2013, 162(2) :1073-1091.

[15]SU X H，LI Q L，CHEN S Q，et al.Analysis of the transcriptome ofIsodonrubescensand key enzymes involved in terpenoid biosynthesis[J].Biotechnology & Biotechnological Equipment，2016, 30(3): 592-601.

[16]马转转，庞潇卿，谌 容，等.萜类化合物生物合成途径中关键酶的研究进展[J].杭州师范大学学报(自然科学版)，2015, 14(6):608-615.

[17]YANG L，DING G H，LIN H，et al.Transcriptome analysis of medicinal plant salvia miltiorrhiza and identification of genes related to tanshinone biosynthesis[J].PLoS One，2013, 8(11): e80464.

[18]马 靓，丁 鹏，杨广笑，等.植物类萜生物合成途径及关键酶的研究进展[J].生物技术通报，2006(增刊):22-30.

[19]占爱瑶，由香玲，詹亚光.植物萜类化合物的生物合成及应用[J].生物技术通讯，2010, 21(1):131-135.

[20]李军玲，罗晓东，赵沛基，等.植物萜类生物合成中的后修饰酶[J].云南植物研究，2009, 31(5):461-468.

[21]陈 建，赵德刚.植物萜类生物合成相关酶类及其编码基因的研究进展[J].分子植物育种，2004, 2(6) :757-764.

[22]岳跃冲，范燕萍.植物萜类合成酶及其代谢调控的研究进展[J].园艺学报，2011, 38(2):379-388.

[23]朱畇昊，苏秀红，董诚明，等.冬凌草AACT基因的克隆与表达分析[J].中药材，2016(1):37-41.

[24]朱畇昊，爼梦航，苏秀红，等.冬凌草 HMGS 基因的克隆与表达分析[J].作物杂志, 2016(5):25-30.

[25]朱畇昊，苏秀红，董诚明，等.冬凌草1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因克隆与表达分析[J].广西植物，2016, 36(12):1476-1482.

[26]苏秀红，尹 磊，陈随清，等.冬凌草1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR) 基因克隆与分析[J].中国实验方剂学杂志，2016(12):37-41.

[27]苏秀红，尹 磊，陈随清，等.冬凌草异戊烯基焦磷酸异构酶基因(IPI)克隆与分析[J].北方园艺，2016(12):80-85.

[28]李 卿，邸 鹏，陆文铨，等.丹参柯巴基焦磷酸合酶的生物信息学分析[J].中草药，2015，46(6):887-894.

[29]JIN B，CUI G，GUO J，et al.Functional diversification of kaurene synthase-like genes [J].Plant Physiology(Preview)，2017，174(2):943-955.

[30]何云飞，高 伟，刘塔斯，等.二萜合酶的研究进展[J].药学学报，2011(9): 1019-1025.

[31]GUO J，ZHOU Y J，HILLWIG M L，et al.CYP76AH1 catalyzes turnover of miltiradiene in tanshinones biosynthesis and enables heterologous production of ferruginol in yeasts [J].PNAS，2013, 110(29)：12108-12113.

[32]黄晓斌，仲蕾蕾.遗传改造酿酒酵母生产植物萜类药物的策略[J].微生物学通报，2015, 42(10): 2019-2025.

[33]张松涛，陈红丽，崔 红，等.植物MEP途径的代谢调控机制[J].西北植物学报，2010, 32(7)：1500-1504.