一株抗镉真菌的鉴定及其抗性的初步研究

于洪飞，刘 森

(河南理工大学资源环境学院，焦作 454000)

煤炭作为主要能源，在相当长的时期内，在我国能源结构中的地位不会改变[1]。然而，煤中含有多种有害或潜在有害元素，在其采集、洗选、储存、运输过程中，会释放到周边环境中[2-3]。郭二果等[4]研究发现与采矿前比，土壤中As、Hg、Cu、Cd等重金属含量均高于采矿前水平。马从安等[5]对胜利露天煤矿重金属含量调查，发现重金属Cd的含量已经超标。煤矿区土壤中Cd和Pb对人体健康存在健康风险[6]，因此，矿区污染土壤的修复显得尤为重要。在自然界中，微生物在重金属的迁移、转化过程中起着重要作用，可对土壤中的重金属进行固定、移动或转化，改变它们在土壤中的环境化学行为，可促进有毒、有害物质解毒或降低毒性，从而达到生物修复的目的[7]。

本文采用浓度梯度驯化的方法[8]，从校园内长期堆放煤的下层土壤中筛选出对镉具有较强抗性的真菌，运用传统形态学方法和18S rDNA序列分析对菌株进行了鉴定，同时研究菌株对Pb2+、Zn2+、Cu2+、Ni2+、Co2+和Cr2+的重金属抗性，为其实际应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 抗镉菌株的筛选与培养

采用梯度浓度驯化法，从河南理工大学校园内煤场采集土样，称取3份土样各10 g加入到90 mL的马铃薯葡萄糖(简称PDA)液体培养基(其中Cd2+浓度为100 mg/L)摇床培养3 d(28℃，150 r/min)，取培养液10 mL加入到PDA液体培养基(Cd2+浓度为200 mg/L)摇床培养3 d(28℃，150 r/min)，依此类推，镉浓度逐渐递增，最后Cd2+浓度达到2000 mg/L。取最后一批的培养液，将菌液涂布于镉离子抗性平板(浓度为2000 mg/L的PDA固体培养基)，培养分离菌株。

1.2 形态与分子鉴定

1.2.1 形态鉴定

将1.1分离的菌株接种于PDA平板上，置于28℃下培养5 d，期间观察菌落的颜色和形态。并在显微镜下观察菌丝、分生孢子梗及分生孢子的形态特征。根据《真菌鉴定手册》[9]和《植物病原真菌学》[10]进行鉴定。

1.2.2分子鉴定

将菌株接种到PDA液体培养基中，摇床培养(28℃，150 r/min)3 d后抽滤得到新鲜的菌丝体。使用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒(No.B518229，上海生工生物工程有限公司)提取基因组。

采用NS1(5′-gTAgTCATATgCTTgTCTC-3′)和NS8(5′-TCCgCAggTTCACCTACggA-3′)两个通用引物扩增18S rDNA序列[11]。PCR反应体系(25 μL)：基因组DNA 0.5 μL，引物 (25 μmol/L)各 1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，Taq酶0.25 μL，MgCl21.5 μL，ddH2O 16.25 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，30个循环；72℃延伸10 min。1%琼脂糖电泳检测，采用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(NO.B518131，上海生工生物工程有限公司)回收目的片段。

利用T4 DNA Ligase将其与pUCm-T 载体连接形成克隆质粒，再将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，使用选择性LB琼脂平板筛选含重组质粒的白色克隆，提取质粒。通过上海生工生物工程有限公司测序，获得的序列提交到NCBI数据库，并应用BLAST 程序与数据库中已有的基因序列进行同源性比对分析。应用MEGA6.0以N-J方法构建系统发育树，对菌株进行系统发育分析。

1.3 菌株对其他重金属的抗性检测

用MIC(Minimal Inhibitory Concentration，最低抑菌浓度)来表示菌株对重金属的抗性，MIC值越大，表示菌株对重金属的抗性越大，反之，抗性越小。分别配制不同质量浓度的Pb2+、Zn2+、Cu2+、Ni2+、Co2+和Cr2+重金属离子的抗性平板。用打孔器(直径0.5 cm)从培养好的平板上打取菌落接种于抗性平板上，每个浓度3个重复，倒置培养(28℃)2 d后，开始观察并记录菌落直径，以24 h内菌落直径变化不显著的视为不生长，被完全抑制。

2 结果与分析

2.1 镉抗性菌株的筛选与形态鉴定

采用梯度浓度驯化方法筛选抗镉菌株，当镉离子富集浓度达到800～2000 mg/L之间时，发现培养基中只有一种真菌存在，培养液呈清澈透明状，悬浮着大量表面粗糙的菌丝球，长势良好，抗性平板培养后，得到一株抗镉真菌，编号为M2。

菌株M2在PDA平板上初期菌丝为白色，疏松的绒毛状，培养到72 h，菌落墨绿色丝绒状，呈放射状向外扩展，老熟后呈黑色，表面平伏，似毡状(图1)。分生孢子梗褐色，有隔，单生或簇生，直或弯曲(图2-A)。分生孢子暗褐色，弯曲或呈新月形，大小(25～27.5)μm×(10～15)μm，具隔膜3个，大多4胞，中间两个细胞膨大，其中从基部向上数第3个细胞特别大，颜色深；两端细胞稍小，颜色浅(图2-B)。

根据以上特征，菌株M2符合关于新月弯孢霉特征的描述报道[5-6]，初步鉴定为新月弯孢霉 (Curvularialunata)。

图1 菌株M2在PDA平板上的菌落生长状态Fig 1 The growth state of strain M2 on PDA plate culture medium

图2 菌株M2的分生孢子梗及分生孢子(40×10)Fig 2 Sporangiophore and conidia of strain M2(40×10)

2.2 分子生物学鉴定

采用试剂盒提取到高纯度基因组DNA，并成功扩增出18S rDNA基因(1731 bp)。通过同源性比对发现，M2(GenBank登录号：KX852423)与Cochltobolussp.，Cochliobolusgeniculatus，Cochlioboluslunatus亲缘关系接近，处在同一个大的分支。且与Cochlioboluslunatus(GenBank登录号：JN941608.1)同源性达100%，序列覆盖率100%。通过系统发育分析(图3)，鉴定菌株M2属于真菌界(Fungi)、双核亚界(Dikarya)、子囊菌门(Ascomycota)、 子囊菌亚门(Pezizomycotina)、座囊菌纲(Dothideomycetes)、格孢菌亚纲(Pleosporomycetidae)、格孢菌目(Pleosporales)、格孢菌科(Pleosporaceae)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)月状旋孢腔菌(Cochlioboluslunatus)。

图3 以18S rDNA基因序列为分子标记的系统进化树Fig 3 The phylogenetic tree based on 18S rDNA sequences

2.3 菌株M2对镉离子的抗性检测

菌株M2在镉浓度500 mg/L到4000 mg/L的平板上均能生长，随培养时间的延长，各个浓度下菌株M2的菌落直径均缓慢增加，且随镉浓度的逐渐提高，菌株生长速度缓慢，菌落直径增加的幅度变小(图4)。镉浓度在500～2000 mg/L时，菌落直径在24 h内变化明显，而高于2000 mg/L时，菌落直径在24 h内增长幅度较小。当镉浓度为4000 mg/L时，镉抑制作用增强，菌落直径增长不明显。可见，镉对菌株M2的最低抑菌浓度为4000 mg/L。同时还发现，在镉抗性平板上的菌落中央菌丝体呈现灰色，边缘乳白色，菌丝体紧密有褶皱，并分泌有褐色色素渗入培养基中，菌丝表面不易形成粉末状孢子。

2.4 菌株M2对其他重金属的抗性检测

用MIC来表示菌株M2对铅、铜、锌、镍、钴和铬的抗性。随着重金属浓度的增加，菌株M2对各个重金属表现出不同的耐受性。低浓度的铅对M2的抑制作用不明显，当铅质量浓度大于1000 mg/L时，抑制作用增强，铅质量浓度达到1500 mg/L时，菌株生长被抑制，菌落直径24 h内基本不变(图5-A)，菌株M2对铅具有很强的抗性。菌株对锌、铜抗性也较强，当锌和铜质量浓度分别达到600 mg/L和400 mg/L时，基本抑制了M2的生长(图5-B、C)，锌抗性平板上，菌落周围亦产生褐色色素渗入培养基中。铜抗性平板上的菌落颜色偏深蓝绿色。重金属镍、钴、铬对菌株的毒害作用较强，当镍、钴、铬的质量浓度分别为100、80和60 mg/L时，M2的菌落直径比接种时直径(0.5 cm)只增加0.2～0.5 cm，可能是借助接种时带入的培养基才有少量增长(图5-D、E、F)。由图5的抗性结果可知，铅、锌、铜、镍、钴和铬对菌株M2的最低抑菌浓度分别为1500、600、400、100、80和60 mg/L。

图4 不同质量浓度Cd2+对菌株M2菌落直径的影响Fig 4 Influences of different mass concentrations of Cd2+ on the colony diameters of strain M2

图5 不同质量浓度重金属对菌株M2菌落直径的影响Fig 5 Influences of different mass concentrations of heavy metal on the colony diameters of strain M2

3 讨论

采用梯度浓度驯化的方法从校园内煤场土样中分离得到抗镉真菌M2，它在镉浓度为2000 mg/L的液体培养基中生长良好，抗镉性较强。根据形态学鉴定菌株M2为弯孢霉属(CurvulariaBoedin)新月弯孢霉 (Curvularialunata)。通过18S rDNA序列分析鉴定菌株M2为旋孢腔菌属(Cochliobolus)月状旋孢腔菌(Cochlioboluslunatus)。弯孢霉属的有性态是旋孢腔菌属(Cochliobolus)、拟旋孢腔菌属(Pseudocochliobolus)[9-10,12]。月状旋孢腔菌为旋孢腔菌属的模式种[13]，新月弯孢霉即为月状旋孢腔菌的无性态。因此，两种鉴定方法结果一致。研究发现，菌株M2对多种重金属有抗性，强弱顺序为Cd2+> Pb2+> Zn2+> Cu2+> Ni2+> Co2+> Cr2+。

国内外报道的镉抗性真菌种类主要有Metarhiziumanisopliae、Saccharomycescerevisiae、Fusariumoxysporum、Phomopsissp.[8]、Phanerochaetechrysosporium[14-15]、Paecilomyceslilacinus[16]、Gliocladiumviride、Mucorsp.和Aspergillusniger[17]。关于新月弯孢霉的研究，集中在产甾体化合物，产絮凝剂和产漆酶[18-19]等方面。新月弯孢霉对重金属的抗性尤其是对镉的抗性研究报道较少，冯宏等[20]从电子垃圾污染区土壤得到一株新月弯孢霉Cd7，其可在镉质量浓度为2000 mg/L的PDA抗性平板上生长，菌株Cd7对9种重金属离子抗性的强弱顺序依次为：Zn2+、Cd2+(>2000 mg/L)>Pb2+(1500 mg/L)>Cu2+(500 m/L) >Co2+(100 m/L)> Ni2+、Cr2+(50 mg/L)>Hg2+、Ag+(25 mg/L)。M2和Cd7对铅、铜、钴、镍和铬的抗性差别不大，但对镉和锌的抗性上有较大区别。菌株M2可在镉质量浓度为4000 mg/L的平板上生长，比Cd7的镉抗性强。而Cd7可在锌质量浓度为2000 mg/L的平板生长，比M2的锌抗性强。这可能是由于两个菌株分离来源不同，生存环境有差异，对重金属的抗性有所不同。

从煤场区土壤中分离得到菌株M2，能够在煤矿环境中生存，并对各种重金属有一定的抗性。今后可进一步对其抗重金属机制进行探讨，为生物法修复煤矿重金属污染提供有力的理论支持。

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