体细胞克隆猴的诞生及展望

廖兆蒂，刘 真，孙 强

(中国科学院 上海生命科学研究院，上海 200031)

作为第一个由体细胞克隆出的哺乳动物，克隆羊Dolly的诞生为人们研究哺乳动物体细胞重编程开启了一扇新的大门[1]。Dolly之后，科研工作者们便对体细胞重编程寄予了厚望并且相继克隆出牛[2]、小鼠[3]、猫[4]等另外22种哺乳动物[5]，然而克隆灵长类动物截至2018年初依然是该领域的一个未解难题[6]。

1 灵长类克隆研究的发展历程

其实早在1997年美国俄勒冈灵长类研究中心的Don Wolf实验室就已经成功克隆出一雄一雌两只恒河猴，但囿于当时实验条件限制该研究仅采用6～16细胞时期早期胚胎细胞作为核供体细胞[7]。2002年，同样来自Don Wolf实验室的Mitalipov以论文第一作者的身份在Biology of Reproduction发表了一篇利用恒河猴体细胞作为供体进行核移植的研究[8]。该研究将30枚由卵裂球做为核供体获得的胚胎(embryonic cell nuclear transfer, ECNT)和14枚体细胞做为核供体获得的胚胎(somatic cell nuclear transfer, SCNT)分别移植入11只和3只受体，11只ECNT受体中只有一个怀孕并在155天时剖腹产获得一个死胎，3只SCNT受体没有一只怀孕。2003年，Schatten和同事将33枚克隆胚胎移植入16只受体但都没有观察到怀孕迹象，然而他们在116枚ECNT和30枚SCNT胚胎中观察到几乎所有这些核移植胚胎在有丝分裂时都发生了纺锤体紊乱和染色体错位等现象[9]。Schatten等认为移除纺锤体导致了MII卵母细胞中核有丝分裂器(nuclear mitotic apparatus，NuMA)和驱动蛋白相关蛋白(kinesin-related protein，HEST)的缺失或损伤，并进而导致灵长类克隆胚胎不能正常有丝分裂。随后，Paolo Martelli实验室在2004年发表的一篇研究中进一步描述了该现象：重组胚胎中仅有14.8%能够形成正常的纺锤体并进行正常有丝分裂，其他大部分胚胎在微管组装、染色体形成、纺锤体形成中都有或多或少的问题[10]。与之前Mitalipov和Schatten等的研究成果相似，Martelli及同事共将93枚体细胞重组克隆胚胎移植入31只受体中，虽然超声检查发现有7只怀孕，但孕期都没有超过60 d。

多次的失败和技术的更新促使该领域研究人员优化体细胞克隆条件。核移植实验传统的去核方法是在看不到纺锤体的情况下去核，即“盲吸法”。这种方法要求操作人员要首先在看不到核的情况下吸除第一极体及极体下10%左右的胞质，然后用bisBenzimide(Hoechst 33342)将吸出的胞质染色，最后在荧光显微镜下观察被染色的胞质中纺锤体是否被吸出。2004年，Martelli团队在研究胚胎重组后的第一次有丝分裂时首次使用Spindle View技术来去除卵母细胞的纺锤体，这是偏振光技术在灵长类克隆领域的首次尝试[10]，而SpindleView也是后来OosightTM Imaging System的雏形[11]。2007年，Wolf等利用lamin A/C(一种核蛋白，可用来标记细胞分化)来比较传统核移植方法与OosightTM Imaging System所得到的克隆胚胎的差异[11]。对比表明利用偏振光去核不仅将去核成功率提高到100%，更重要的是将去核时间缩短到1 min之内，避免了传统染料染色、紫外照射等对胚胎造成的伤害。解决了传统的“盲吸法”去核对卵母细胞造成损伤这一问题后，Mitalipov等进一步对细胞融合这一过程进行了改造。Mitalipov等认为传统电刺激促使卵母细胞和体细胞融合的方法会导致细胞过早激活，所以在2010年发表的研究中使用仙台病毒(Sendai virus, SeV)介导其融合[12]。另外，在重组胚胎激活的时间上也有了改进，研究发现重组胚胎融合后立即激活的囊胚率(20%)比融合2 h后再激活的囊胚率(12%)更高[12]。通过这些技术和方法上的改进，Mitalipov等将恒河猴体细胞克隆囊胚发育率提升了3倍，核移植囊胚用于干细胞建系的成功率(29%)也比之前大大提升，为之后人的克隆胚胎建系提供了重要的参考价值。另一方面，尽管技术上的改进提高了囊胚发育率，在该工作中移植的67枚胚胎中只有一枚发育成胎儿并检测到心跳，且在妊娠第81天流产[12]。

由于哺乳动物克隆胚胎普遍存在发育率和存活率极低的现象，研究人员开始研究体细胞重编程的机制并试图寻找一些能够提高哺乳动物克隆效率的因子。2005年，Wakayama团队首次使用一种组蛋白去乙酰化抑制因子曲古抑菌素A(histone deactylase inhibitor A, TSA)来处理重组胚胎从而将重组胚胎的囊胚率提高了2～5倍，并发现经过TSA处理的克隆胚胎干细胞建系效率比未处理的胚胎提高了至少3倍[13]。2007年，这一团队利用TSA处理后的ICR克隆胚胎克隆出第一个封闭群小鼠[14]。2009年，Wakayama团队使用另一种组蛋白去乙酰化抑制因子SCR(scriptaid)替代TSA并首次克隆出近交系小鼠[15]。此后多项研究也都证实了TSA和SCR可明显提高克隆胚胎的囊胚率[16-17]。Mitalipov在2010年发表的研究中也使用了TSA来处理灵长类克隆重组胚胎，研究表明TSA处理后的实验组囊胚率可达到18%，明显高于对照组5%的囊胚率[12]。尽管该实验对胚胎操作和培养都有优化，但依然没有个体存活[12]。

哺乳动物克隆的另一重大意义是使体细胞经过重编程后从高度分化状态还原到未分化状态，因此克隆胚胎用来建立干细胞系就变得尤为重要。Mitalipov等在2007年采用成年雄性恒河猴的皮肤细胞进行核移植，首次建立了两支克隆猴胚胎干细胞系(cloned rhesus embryonic stem)，CRES-1和CRES-2[18]，两支雌性干细胞系(CRES-3和CRES-4)也在2009年通过同样的方法建立[19]。随后Mitalipov等对这些克隆干细胞系进行了表观研究并发现，CRES中H3K9me3要比其在体细胞中的甲基化程度低很多，而二者H3K27me3、H3K4me3的表达水平则相似，并且CRES中H3K9me3、H3K27me3和H3K4me3的表达量与正常体外受精的囊胚建立的干细胞系(ORMES)相似[19]。2014年哈佛大学张毅实验室通过对小鼠胚胎二细胞时期的转录组比较分析发现，核移植胚胎中存在一些重编程抗性区域(reprogramming resistant regions, RRRs)，而这些RRRs区基因在体外受精的二细胞胚胎中正常表达[20]。更有趣的是，由于体细胞中这些RRRs区基因多富集H3K9me3，在胚胎中外源表达Kdm4d(一种H3K9me3去甲基化酶)不仅可以将这些基因重新激活，还可大幅度提高小鼠体细胞克隆的效率。利用H3K9甲基化酶基因Suv39h1/2敲除的体细胞作为核供体也可提高克隆效率。因此该研究认为H3K9me3是影响核移植介导的哺乳动物体细胞重编程过程中一个至关重要的表观因素[20]。在此之前，2012年来自新西兰的Götz Laible实验室就用Kdm4d同一家族的Jmjd2b(也叫Kdm4b)基因打靶干细胞，并利用阳性细胞作为供体进行小鼠核移植实验[21]，但可惜的是干细胞注入胚胎后不久其H3K9me3的表达就恢复成正常细胞的水平。所以最终该研究表示虽然对干细胞的基因操作改善了小鼠核移植胚胎的囊胚发育率，但实验组与对照组胚胎着床比例并没有显著差别。

克隆猴“中中”和“华华”(见图1)之所以能够诞生正是综合了这些改善后的条件并在此基础上对其进一步优化。首先利用偏正光核示踪技术快速高效地将MII卵母细胞的核去掉；然后将Hemagglutinin Virus of Japan (HVJ-E)病毒处理过的细胞注入去核卵母细胞并介导融合；重组胚胎融合后1 h左右将其激活，激活也相比之前的ionomycin和6-dime-thylaminopurine (I/D)多了TSA，即I/D/T；在激活并培养一段时间后，科研人员将Kdm4d mRNA注入这些激活后的胚胎并获得相较对照组来说较多的优质囊胚(11/17, 64.7%)；另外，优秀的兽医团队在前期取卵，后期胚胎移植、B超检查、孕猴照料和克隆猴生产等工作中的作用也是无可替代的。

图1 150天的克隆猴“中中”(后)和“华华”(前)Fig 1 150 days of cloned monkey "Zhong Zhong" and "Hua Hua"

2 克隆猴诞生的意义与面临的困难

此次体细胞克隆猴的诞生不仅将我们对克隆灵长类动物可行性的认知提升到一个新的台阶，对于人类疾病的相关研究也起到不可替代的作用。目前大多数对于人类疾病(特别是脑疾病)的相关研究仍处于小鼠水平，但小鼠和人之间的物种差异导致在小鼠水平上做出的研究成果很大程度上不能平行迁移到人体水平，这预示着我们仍需非人灵长类(如猴子)来回答小鼠和人都不能回答的问题；另外，许多近交系小鼠如DBA、C57BL、BALB/c、129等由于其广泛的实验可重复性，早已是科研工作中的重要模式生物，然而这些近交系的建立是通过20代以上的不断自交获得的，这对生长发育缓慢、繁殖周期长的灵长类动物来说显然是不现实的。体细胞克隆技术可以帮助我们得到一群基因背景近乎一致的猴子，极大地克服了灵长类动物之间个体差异大、实验可重复性差等缺陷；还可对体细胞定向基因打靶，通过一系列筛选步骤筛选出阳性克隆后将其用作核移植的供体细胞，从而克隆出特定的疾病模型猴并进一步开展相关疾病的研究；通过这种方法获得的基因编辑猴在F0代不会出现嵌合体；最后，由于疾病模型猴的基因背景一致，可大大减少生物医疗领域实验动物的使用量，帮助筛选人类疾病的有效药物，缩减新药研发、临床实验等的周期和费用。

尽管如此，灵长类克隆研究领域依然还有很多问题需要回答：1)这项研究所用的体细胞是流产的胎猴成纤维细胞，成年猴子成纤维细胞或其他类型细胞作为供体的可行性依然面临挑战； 2)仍没有利用该方法出生的特定疾病猴模型或者工具猴模型；3)Kdm4d主要作用于早期胚胎发育，提高囊胚发育率，但对胚胎着床后的发育影响仍未可知。

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