早期体内力学刺激促进藻酸钙复合自体软骨细胞修复羊关节负重区软骨缺损的实验研究

郝春香，马宁，眭翔，王鑫，万一群，卢世璧，刘舒云，郭全义



早期体内力学刺激促进藻酸钙复合自体软骨细胞修复羊关节负重区软骨缺损的实验研究

郝春香，马宁，眭翔，王鑫，万一群，卢世璧，刘舒云，郭全义

100853 北京，中国人民解放军总医院麻醉科（郝春香），骨科研究所，北京市再生医学重点实验室/全军战创伤重点实验室（马宁、眭翔、王鑫、万一群、卢世璧、刘舒云、郭全义）

观察膝关节持续被动活动仪（CPM）体内力学刺激对组织工程软骨修复大动物关节负重区软骨缺损效果的影响。

研究、设计和制造能够适用于体内力学刺激羊膝关节软骨缺损修复的膝关节连续被动活动仪（CPM）；将实验动物（山羊膝关节双髁负重区制造直径 6 mm 软骨缺损）分为三组：空白组：单纯缺损未植入修复组织；藻酸钙+ 骨膜+ 细胞组：藻酸钙复合自体软骨细胞凝胶植入软骨缺损区，自体骨膜覆盖缺损区；藻酸钙+骨膜+细胞 + CPM 组：藻酸钙复合自体软骨细胞凝胶植入软骨缺损区，自体骨膜覆盖缺损区，术后早期接受 CPM 锻炼。分别于术后3 个月、6 个月、12 个月（12 个月组仅包括 CPM 力学刺激组）取材，通过修复组织的大体、组织学观察及其评分比较 3 组软骨修复效果。

藻酸钙复合软骨细胞能够较好地修复羊负重区关节面软骨缺损，将缺损修复的大体观察、组织学等结果进行单因素统计学分析，发现接受体内 CPM 力学刺激组效果最好，其修复组织中透明软骨比例最多，其次为藻酸钙+ 骨膜+ 细胞组。

膝关节持续被动活动仪（CPM）体内力学刺激能够促进组织工程软骨修复大动物关节负重区软骨缺损的效果。

软骨，关节； 软骨细胞； 藻酸钙； 连续被动活动仪

近几年，软骨组织工程再生研究取得了令人瞩目的成果，但目前的软骨组织工程技术，还难以保证植入细胞产生足够的细胞外基质来构成再生软骨组织，导致关节软骨修复组织出现力学性能不足及远期退变问题。在软骨组织再生修复过程中，再生软骨组织本身的动态受力情况决定了其空间结构和力学性能，进一步影响功能性软骨的再生，因此力学环境在关节软骨的生长过程中发挥重要的调节作用[1-3]。本实验选择了大动物（中国山羊）模型，以藻酸钙复合自体软骨细胞凝胶作为移植物，通过术后早期接受持续被动活动仪（CPM）给予关节软骨体内力学刺激，观察膝关节负重区软骨再生修复的结果，探讨力学刺激对组织工程软骨修复效果的影响。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

成年（25.0 kg以上）中国山羊，购于解放军总医院动物中心。软骨细胞培养用 D-hanks平衡液、软骨细胞培养基、0.2% II型胶原酶、藻酸（低黏性，粉剂）、氯化钙、EDTA、柠檬酸钠、二甲基亚甲蓝均购于美国 Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 羊膝关节连续被动活动仪的设计和制造 ①羊固定架的制造和改进：按照固定、连接、活动等要求，设计各部位配件的图纸并制造山羊直立位固定架。当羊被固定时，由于羊的腹部压力大，不能保证较长时间活动过程的饮食，另外患肢以外的肢体活动范围过大，羊在活动过程中容易摔倒，继而引起被固定肢体骨折的可能性，因此，模仿宠物背心，用帆布带做成悬吊带，把羊悬吊固定。②驱动机构和控制系统：把人踝关节的 CPM 驱动机构作为该实验的驱动机构和控制系统，调整原来的角度参数，根据机械传动机构的变化换算出新的角度参数，时间参数不变。③羊下肢固定机构：用钢板加工成半圆形固定器，其突侧有螺纹和机械传动机构相连，固定羊腿时该半圆形固定器和同样大小的另一半圆形固定器（由普通石膏绷带制作）夹住羊腿，再用普通绷带缠绕两个半圆形固定器，固定器和羊腿间垫入海绵，减少固定器引起的羊腿皮肤摩擦性损伤。④机械传动机构：用圆形螺纹钢、钢管和与其垂直的滑槽钢板把驱动机构和羊下肢固定机构连在一起，螺纹钢和钢管间的相对水平滑动可以调节羊和机器之间的距离，滑槽钢板的上下移动可以调节膝关节屈伸的范围，以适应不同身高羊膝关节的活动。

1.2.2 自体软骨细胞的培养 麻醉药品采用速眠新 2 号与氯胺酮混合液，两者配比为 1/2（V/V），按照 0.20 ml/kg 肌肉注射麻醉山羊。取肩关节外侧弧形切口切开皮肤和皮下组织，削取肱骨头关节表面软骨 100 ~ 140 mg，剪成 1 mm3大小的碎块，用 0.2% II 型胶原酶消化，获得原代软骨细胞，在 37 ℃、5% CO2的培养箱内进行培养。

1.2.3 软骨细胞-藻酸钙凝胶复合物的构建 选用 P3代以内具有正常表型的羊关节软骨细胞和 1.2% 无菌藻酸钠溶液混合（细胞密度为 2 × 106/ml），将混合液滴入 102 mmol/L 的氯化钙溶液，形成藻酸钙软骨细胞凝胶，将藻酸钙软骨细胞凝胶复合物悬浮于软骨细胞培养液内，在 37 ℃、5% CO2的培养箱内进行培养。

1.2.4 山羊膝关节股骨髁负重区全层软骨缺损修复实验 将实验动物（山羊）分为 3 组：空白组：单纯缺损未植入修复组织组；藻酸钙+ 骨膜+ 细胞组：藻酸钙复合自体软骨细胞凝胶植入软骨缺损区，自体骨膜覆盖缺损区；藻酸钙+ 骨膜+ 细胞+ CPM 组：藻酸钙复合自体软骨细胞凝胶植入软骨缺损区，自体骨膜覆盖缺损区，术后早期接受 CPM 锻炼。

山羊术前禁食禁水，术中麻醉，取膝关节正中入路，进入关节腔，暴露股骨内外髁。用直径 6 mm 环钻和圆凿分别在内髁或外髁或双髁上做直径6 mm、深 2.0 ~ 2.5 mm 全层软骨缺损。于胫骨结节平面向内侧延长切口，锐性分离胫骨近端表面筋膜，根据需要用直径10 mm的环钻和手外科骨膜剥离子，切取直径为 10 mm 的骨膜。将藻酸钙软骨细胞凝胶复合物置于缺损内，骨膜覆盖缺损并用 7/0 的显微外科缝线固定骨膜（将缺损周边五等分，分别于五等分的每个点软骨下骨向股骨髁的内外侧打隧道，缝合线通过隧道固定骨膜于软骨缺损处，防止植入的藻酸钙软骨细胞凝胶复合物脱落），逐层闭合关节。每只动物术日和术后 7 d 肌肉注射青霉素 160 万 U，每日 2 次。

术后第一天把动物送回动物室放养，接受膝关节 CPM 活动组，于术后第一日患肢接受 CPM 活动，上下午各 3 h，持续活动 14 d。根据分组不同，于手术后 3 个月、6 个月、12 个月分别处死山羊，摄取关节大体像及修复组织并留取标本。

1.2.5 大体观察及组织学评价羊关节软骨修复效果 各组动物取材时，从缺损边缘修复情况、软骨表面平整度、缺损填充、新生软骨的颜色和透明度等方面进行修复组织的大体评分。将 10% 中性福尔马林固定一周的标本，用 15% EDTA 脱钙，梯度酒精脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋，5 μm 切片，HE、番红O、甲苯胺蓝、II 型胶原免疫组化染色，光镜下观察。软骨缺损修复病理评分借鉴 Wakitani 等评分标准（表 1），该评分标准由五项指标组成，记分范围从 0 ~ 14 分，得分越低，表示新生修复组织越接近正常。

表 1 Wakitani 软骨缺损修复病理评分

图 1 羊膝关节被动活动仪[A：双羊 CPM 活动仪（箭头处装置可以上下调节，适应不同身高羊使用）；B：双羊同时接受 CPM 活动仪治疗；C：羊接受 CPM 活动（膝关节屈曲位）；D：羊接受 CPM 活动（膝关节伸直位）]

Figure 1 Continuous passive motion device for goat [A: Continuous passive motion device for goat (the element the arrow points can be adjusted for different height of the goat); B: Two goats accepted the CPM exercise at the same time; C: Flexion position of knee joint; D: Extension position of knee joint]

表 2 实验动物各组缺损数及成功取材缺损数

2 结果

2.1 羊膝关节连续被动活动仪的设计和制造

羊 CPM 机的整体结构见图 1，该机器能够安全、简捷地把羊固定于直立位。羊被固定以后，其他肢体可以任意活动，而且在固定期间不影响饮食。本机器可以带动单羊，也可以带动双羊进行膝关节的持续被动活动。羊膝关节屈伸活动的频率和时间可以自由设定，活动的频率范围为 2 ~5 次/min，轴心上下活动的范围为 20 cm，滑槽钢板的上下移动范围为 10 cm，羊膝关节屈伸角度的可调节范围为 30° ~ 135°。

2.2 构建软骨细胞-藻酸钙凝胶复合物

倒置显微镜下观察软骨细胞-藻酸钙凝胶，可见藻酸钙交联形成很多垂直于表面的孔道，软骨细胞位于其中，软骨细胞在藻酸钙中呈丛状或球状生长，细胞在整个培养过程保持球形状态。碘化丙啶标记藻酸钙凝胶中的软骨细胞，荧光显微镜观察可见部分死亡的软骨细胞呈红色，正常细胞不着色，活细胞大于 95%；藻酸钙细胞复合物染色可见番红O染色、甲苯胺蓝染色呈阳性，说明凝胶中的细胞具有软骨细胞的表型。

2.3 大体观察

动物的分组根据不同时间进行穿插分组，如空白对照组施行左膝关节手术后，3 个月再接受右膝关节手术，距初次手术 6 个月取材时，左侧膝关节为 6 个月组，右侧膝关节为 3 个月组，因此，为了便于分析，以软骨缺损为单位进行统计（表 2）。全部羊到取材时行走无跛行，行走和跑步速度正常，手术切口无红、肿及异常分泌物。各组关节取材前检查可见：全部关节屈伸活动达到正常关节活动范围，关节腔无感染，关节囊愈合好，无挛缩，髌骨无脱位，滑膜无粘连，无植入的软骨细胞-藻酸钙凝胶脱落。利用 SPSS 10.0 软件，单因素分析的方法对上述各组 3 个月组和 6 个月组的大体评分结果（图 2）进行统计学分析（α = 0.05），结果显示各组修复效果有统计学差异。

图 2 软骨缺损修复大体观察评分（A：空白组；B：藻酸钙 + 骨膜 + 细胞组；C：藻酸钙 + 骨膜 + 细胞 + CPM 组）

Figure 2 Macroscopic grading of repaired articular cartilage (A: Control group; B: Calcium alginate + periosteum + cells group; C: Calcium alginate + periosteum + cells + CPM group)

图 3 羊膝关节软骨缺损修复组织 II 型胶原免疫组化染色

Figure 3 Type II collagen immunochemistry staining of repaired tissue of goat articular cartilage

2.4 组织学观察

空白 3 个月组和 6 个月组主要为纤维软骨修复，软骨基质甲苯胺蓝染色较浅。藻酸钙+ 骨膜+ 细胞组 3 个月组和 6 个月组，修复以透明软骨为主，基质甲苯胺蓝染色接近周围正常软骨，II 型胶原染色阳性（图 3）。藻酸钙+ 骨膜+ 细胞+ CPM 3 个月组和 6 个月组，缺损修复组织为透明软骨修复，基质甲苯胺蓝和 II 型胶原染色均较藻酸钙+ 骨膜+ 细胞组更深（图3）。软骨缺损修复病理观察评分见图 4。利用 SPSS 10.0 软件，单因素分析的方法对上述各组 3 个月组和6 个月组的病理评分结果进行统计学分析（α = 0.05），结果显示各组修复效果有统计学差异。一年组观察修复的软骨组织未出现退变。

3 讨论

软骨组织没有血管、淋巴管和神经纤维，软骨细胞稀疏分散于由水和大分子物质组成的细胞外基质中[4]。营养物质借助关节液扩散入透明软骨基质，达到营养传递的目的[5]。正常透明软骨细胞代谢，必须具备两个条件：①关节腔具有功能正常的滑膜，能够产生营养软骨细胞的关节液；②关节液能够通过基质扩散到深层的软骨细胞[6]。关节活动与软骨的代谢直接相关，保持持续的关节活动不仅有利于关节液在关节腔和软骨之间的交换，保证软骨细胞营养的摄取和代谢产物的排出[7-8]，而且保证了软骨细胞不断受到力学的刺激，有利于软骨细胞表型和功能的维持。通过对关节解剖结构的研究以及大量患者临床手术的观察，发现关节连续被动活动仪（CPM）在关节损伤的治疗和康复中所起的作用主要表现在：①有利于关节软骨和关节周围组织营养物质的摄取和产物的代谢；②对于软骨损伤的患者，CPM 能够刺激未分化的多潜能间充质干细胞向软骨细胞分化，利于软骨的修复；③CPM 用于关节活动，加速了关节软骨和周围组织的愈合，如 CPM 有利于关节周围的韧带和肌腱的修复[6-7]。CPM 可帮助关节损伤的患者进行关节的持续被动活动，因此成为自体软骨细胞移植修复软骨损伤的又一干预因素。

图 4 软骨缺损修复病理评分（A：空白组；B：藻酸钙 + 骨膜 + 细胞组；C：藻酸钙 + 骨膜+ 细胞 + CPM 组）

Figure 4 Histological grading of repaired cartilage (A: Control group; B: Calcium alginate + periosteum + cells group; C: Calcium alginate + periosteum + cells + CPM group)

本研究设计和制造的羊固定架能够较长时间地保持羊于直立位，防止膝关节活动过程中因摔倒引起患肢或其他部位的骨折或软组织损伤，而且在长时间的膝关节活动中，羊能够自如地饮食，其他三个肢体能够自由地活动，因此该固定架是安全和相对舒适的。羊下肢固定机构能够稳定地把羊的小腿和机械传动机构固定在一起，既能保证羊膝关节的持续屈伸活动，又能保证整个活动过程中膝关节活动度数保持恒定。驱动机构、控制系统和机械传动机构的协调配合能够调整羊和驱动机构的距离、活动的度数、活动的频率以及持续的时间，本机器能够同时进行两只羊的膝关节被动活动，也可进行单只羊的膝关节活动，操作简单、安全、活动角度和时间可控，可作为山羊膝关节手术后早期接受体内力学刺激的辅助设备。

体内实验过程中，为了避免移植到软骨缺损区的软骨细胞-藻酸钙凝胶脱落，采用了 7/0 的显微外科缝线固定骨膜覆盖软骨损伤区，移植物置于骨膜和软骨下骨之间。

从修复组织的病理评分结果看，藻酸钙复合自体软骨细胞+ 骨膜覆盖+ CPM 组的修复效果优于藻酸钙复合自体软骨细胞+ 骨膜覆盖组。病理评分单因素统计学分析发现，藻酸钙复合自体软骨细胞+ 骨膜覆盖+ CPM 组与另两组比较均有统计学差异，说明 CPM 有利于软骨的修复。横向比较可以发现：虽然复合有细胞的两组缺损经过 6 个月的修复，大体和光镜下都有透明软骨形成，表面光滑，和周围整合也满意，但从3 个月的观察结果分析，藻酸钙复合自体软骨细胞+ 骨膜覆盖缺损，接受 CPM 组和未接受 CPM 组相比，前者有明显的软骨细胞基质形成，因为早期应用 CPM 不仅可以使修复区移植的复合体间断接受挤压，刺激软骨细胞分泌软骨基质，还有利于关节液和正常软骨及移植软骨细胞之间营养物和代谢产物的交换，这些作用均利于软骨组织的修复。实验中我们还发现，随时间的推移 CPM 组的软骨组织明显比非 CPM 组光滑、平整。一年组的修复组织，病理评分显示其未出现退变现象，但因其例数较少，尚需进一步长期观察。

自体软骨细胞复合藻酸钙移植，术后接受系统的 CPM 锻炼组修复效果优于未接受CPM 锻炼组，观察一年，未见修复组织退变。本研究为组织工程软骨的临床应用术后早期接受 CPM 康复锻炼提供了实验依据。

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Experimental study of earlymechanical stimulation of calcium alginate combined with autologous chondrocytes in repairing articular cartilage defects of goat's joint weight-bearing area

HAO Chun-xiang, MA Ning, SUI Xiang, WANG Xin, WAN Yi-qun, LU Shi-bi, LIU Shu-yun, GUO Quan-yi

Author Affiliation: Anesthesiology Department (HAO Chun-xiang), Institute of Orthopaedics, Beijing Key Lab of Regenerative Medicine in Orthopaedics/Key Laboratory of Musculoskeletal Trauma & War Injuries (MA Ning, SUI Xiang, WANG Xin, WAN Yi-qun, LU Shi-bi, LIU Shu-yun, GUO Quan-yi), Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

To observe the effect of mechanical stimulation of continuous passive motion (CPM) on repairing articular bearing area cartilage defects of large animals.

① The designed and prepared continuous passive motion could be applied tomechanical stimulation in repairing goat articular cartilage defects of the knee joint. ② A full-thickness articular-cartilage defect (6 mm in diameter) was created in the femoral condyle weight-bearing area of goats. The goats were divided into three groups A, B and C. A was control group of cartilage damaged in the weight area of the knee joint without implantation. B was calcium alginate + periosteum + cells group of cartilage damaged in the weight area of the knee joint repaired by calcium alginate composite chondrocytes and periosteum. C was calcium alginate + periosteum + cells + CPM group of cartilage damaged in the weight area of the knee joint repaired by calcium alginate composite chondrocytes and periosteum with early CPM exercise postoperatively. Results of cartilage repair were assessed after 3, 6 months and 12 months (12 months group only treated by CPM group) by the general, histological observation and score of the repair of tissue.

Calcium alginate composite cartilage cells was able to repair injuried cartilages in the weight area of the goat knee joint. The results of a single factor statistical analysis of the gross and histology observation from defect repair revealed that the effect of CPM mechanical stimulation group was the best, followed by calcium alginate + periosteum + cells group.

Mechanical stimulation of continuous passive motion can promote injuried articular cartilage repair of large animals.

Cartilage, articular; Chondrocytes; Calcium alginate; Continuous passive motion

LIU Shu-yun, Email: clear_ann@163.com; GUO Quan-yi, Email: doctorguo@163.com

国家重点研发计划（2017YFC1103404、2017YFC1104102）；国家自然科学基金（81472092、81772319）；北京市自然科学基金（7172203）；北京市科技专项（Z161100005016059）

刘舒云，Email：clear_ann@163.com；郭全义，Email：doctorguo@163.com

2018-02-28

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.03.003