牛奶中β-内酰胺高灵敏度检测试剂条研制（胶体金法）

宋文 何鲁江

目前，快速检测试剂条一般采用抗原抗体反应的原理来检测目标检测物。但是由于牛奶样本中蛋白质含量较高，容易干扰检测结果，且对于灵敏度要求高，普通的抗体无法达到现场检测灵敏度的要求。胶体金法采用受体结合的原理来检测目标物，由于受体结合的亲和力是抗原抗体结合亲和力的两个数量级以上，因此在牛奶中使用受体结合的原理来制备β-内酰胺高灵敏度检测试剂条成为一个有效的手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

阳性奶样、阴性奶样、酪蛋白、Tris、BSA、Borax等化学试剂（采购自Sigma）。镍柱（GE life）、PET-30a质粒（通用生物）、β-内酰胺BSA偶联物（购自杭州隆基生物）。

1.2 仪器与设备

高速冷冻离心机（湘仪）、摇床（湘仪）、蛋白分离柱（Bio-Rad）、分光光度计（新世纪）。

1.3 方法

1.3.1 重组β-内酰胺受体制备

1.3.1.1 单克隆阳性菌体制备

①将合成的质粒冻干粉使用100μL灭菌超纯水稀释。

②吸取稀释后的质粒溶液10μL，加入到100μL的感受態细胞中，冰浴30min。

③完成冰浴后，42℃金属浴热击90s后冰浴2min。

④将制备好的感受态细胞接种于1mL LB液体培养基（加入终浓度万分之一的卡纳抗生素），37℃ 、250rpm培养1h。

⑤培养后的菌体吸取200μL，涂LB固体培养基平板（卡纳抗性），37℃烘箱静止过夜。

⑥挑取菌落生长旺盛，边缘清晰的单菌落，接种于1mL LB液体培养基，37℃ 、250rpm培养过夜。

1.3.1.2 阳性单克隆蛋白表达鉴定

①吸取单克隆菌10μL，加入到10mL LB液体培养基中（2管），37℃、250rpm过夜培养。

②将10mL培养好的菌体加入到250mL LB培养基培养（37℃ 、250rpm），每1h测试菌体浓度，当菌体吸光度超过0.6之后，加入IPTG诱导蛋白表达（4h），其中一管为对照管不进行诱导。

③将两瓶菌液分别离心10分钟，转速为8000rpm，温度设为4℃。然后弃去上清，将沉淀使用PBS稀释搅拌30min。将稀释后的菌体放入到细胞粉碎仪中粉碎15min。在 12000rpm的转速下离心30min，温度控制为4℃，保留上清。

④离心后的沉淀物使用inding Buffer A（50mM Tris，8M Urea，0.5M NaCl，pH8.0）室温溶解10min后，12000rpm，4℃离心30min，取上清。

⑤将收集到的两份上清进行蛋白电泳。

经蛋白电泳鉴定，β-内酰胺受体蛋白主要为包涵体表达，上清表达量较低。

1.3.2 试纸的制作

1.3.2.1 重组β-内酰胺受体标记胶体金

①500mL超纯水加热至沸腾，加入终浓度为1.5/10000的氯金酸后再加入2.25/10000的柠檬酸三钠。搅拌反应10min后，水浴冷却。

②100mL制备好的胶体金溶液使用0.2M碳酸钾溶液调节PH到9.0，加入重组的β-内酰胺受体蛋白，室温搅拌30min。

③加入1mL 10%的BSA水溶液，封闭30min。

④以12000rpm的转速离心30min，弃去上清，沉淀使用金标保存液稀释（Tris：0.25%、BSA：1%）回收冷藏保存。

⑤将标记好的金标溶液，使用金标稀释液稀释到OD540吸光度为OD5（溶液中加入终浓度为2%的蔗糖和1%的海藻糖），每个酶标孔加入稀释的金标溶液10μL，放置于45℃烘箱过夜干燥。

1.3.2.2 β-内酰胺BSA偶联物包被

①将β-内酰胺BSA偶联物使用PBS稀释到0.2mg /mL（终浓度1%蔗糖）。

②使用划膜仪将稀释好的β-内酰胺BSA偶联物包被到NC膜上，45℃烘箱过夜干燥

1.3.2.3 试纸条组装

将包被好的底板与吸水滤纸、滤膜按照正常程序组装黏贴。

1.3.3 试纸条检测

将青霉素使用阴性奶样稀释，建立梯度浓度标准品，浓度值分别为0.25ppb、0.5ppb、1ppb、2ppb、4ppb、8ppb、16ppb、32ppb。该试纸条采用免疫竞争法原理，阳性为一条线，阴性为两条线。分别吸取不同浓度值的标准质控品各100μL，使用移液器反复抽打10次后将组装好的试纸条插入到酶标孔中10秒钟，5min后观察并记录相应结果。

2 结果与讨论

检测结果（见表1）表明，该方法建立的牛奶中β-内酰胺快速检测试纸条的灵敏度为0.5ppb，当检测样本中的β-内酰胺浓度超过0.5ppb将被检出阳性。