抗抑郁20(S)-原人参二醇型人参皂苷成分分析

杨红艳，龚韦凡，李竣，张华林

（1.岭南师范学院化学化工学院，广东湛江 524048）（2.中南民族大学药学院，湖北武汉 430074）

抑郁症（depression）是一组以显著而持久的心境低落为主要特征的综合症，是常见精神疾病之一。世界卫生组织的统计表明，世界上前10种致人残疾或丧失劳动能力的疾病中，抑郁症居第5位，并且具有逐步上升的趋势。三七叶总皂苷为五加科（Araliaceae）植物三七Panax notoginseng(Burk.) F.H.Chen茎叶的提取物，是传统中成药七叶神安片的主要原料，具有益气安神、活血止痛的功效，临床用于心气不足、心血瘀阻所致的心悸、失眠、胸痛和胸闷等。三七叶总皂苷和来源于三七根茎的三七总皂苷一样含有丰富的人参皂苷成分，不同的是前者主要含 20(S)-原人参二醇（PPD）型人参皂苷，几乎不含 20(S)-原人参三醇（PPT）型人参皂苷[1]。

我们从三七叶总皂苷中进一步的分离、精制获得具有良好抗抑郁活性的三七叶总皂苷提取物，其作用机制涉及五羟色胺能系统（5-HT）、去甲肾上腺素能系统（NE）以及多巴胺能系统（DA）等三种神经递质系统[2]。进一步的分子作用机制研究表明，该提取物的抗抑郁作用也与 cAMP反应元件结合蛋白（CREB）及脑源性神经营养因子（BDNF）这两种与抑郁症相关的神经调节因子以及cAMP-PKA-CREB-BDNF、TrKB-ERK-CREB-BDNF这两条上游神经信号转导通道有密切关联[3,4]。

此外我们从总提取物、有效组分、有效成分三个层面进行药效评价，分析其起效的物质基础，结果表明以人参皂苷Rb3、Rb1、Rb2、Rc和三七皂苷Fc等为代表的PPD型人参皂苷是重要的活性成分[5,6]。

本文针对PPD型人参皂苷成分，采用高效液相色谱法对抗抑郁三七叶总皂苷提取物的成分进行初步的定性分析，并对Rb1、Rc、Fc、Rb2和Rb3这5种活性成分同时进行含量测定，为该活性提取物建立质量标准提供依据，为研发抗抑郁中药新药打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与原料

三七叶总皂苷由本实验室制备，人参皂苷Rb1(批号：GR-134-170304)，人参皂苷 Rb2(批号：GR-133-161129)，人参皂苷Rb3(批号：GR-133-161226)，人参皂苷Rc(批号：GR-134-170107)，三七皂苷Fc(批号：GR-134-170409)以及三七皂苷R1、Fa、Fe，人参皂苷Rg1、Rd、F1、C-K、Rh2、Rg3，原人参二醇等对照品均购自南京泽朗医药有限公司；色谱甲醇、乙腈购自美国Tedia公司；其他试剂为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

Waters 2695高效液相色谱仪，美国Waters公司；Milli-Q plus system超纯水仪，美国Millipore，Milford，MA；KQ-500E型超声仪，昆山市超声仪器有限公司；AL204电子天平，瑞士 MettlerToledo公司；DK-8B型电热恒温水槽，上海精宏实验设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 三七叶总皂苷成分定性分析

色谱条件：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）:0.2%磷酸溶液（B），线性梯度洗脱（V/V），洗脱时间程序见表1，流速0.3 mL/min，柱温35 ℃，检测波长为203 nm，进样量为10 μL。样品溶液制备：精密称取三七叶总皂苷样品适量，置于10 mL容量瓶中，加入适量甲醇，超声溶解，放置室温，定容，摇匀后用0.45 μm微孔滤膜过滤，弃初滤液，取续滤液进样。

表1 梯度洗脱时间程序Table 1 Time program of gradient elution

1.2.2 人参皂苷 Rb1、Rb2、Rc、Rb3与三七皂苷Fc的含量测定

色谱条件：Agela Venusil XBP C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇:0.2%磷酸溶液（70:30），等度洗脱，流速为0.8 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为203 nm，进样量为10 μL。

系列浓度对照品溶液的制备：精密称取Rb1、Rc、Fc、Rb2、Rb3对照品适量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，得对照品储备液。将对照品储备液逐步稀释，得到系列浓度的对照品溶液。

样品溶液制备：精密称取三七总皂苷样品适量，置于10 mL容量瓶中，加入适量甲醇，超声溶解，放置室温，定容，摇匀后用0.45 μm微孔滤膜过滤，弃初滤液，取续滤液进样。

1.2.3 数据分析与处理

人参皂苷成分定性分析研究，采用对照品对照并结合相关文献[7]进行高效液相色谱图分析，确定色谱峰的归属。

含量测定实验线性方程采用SPSS 17.0完成，其他数据结果采用平均值±标准差表示。

2 结果与讨论

2.1 三七叶总皂苷成分定性分析结果

三七叶总皂苷的HPLC图谱（见图1），共标定色谱峰36个。对色谱峰进行定性分析，结果见表2。

图1 三七叶总皂苷HPLC分析图谱Fig.1 HPLC analysis of total saponins from the leaves of Panax Notoginseng

2.2 人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rb3与三七皂苷Fc的含量

2.2.1 色谱条件的确定及系统适应性试验

Rb1、Rc、Fc、Rb2、Rb3均为带4～5 个糖基的PPD型人参皂苷，化学性质较为接近，给色谱分离带来困难，故文献采用梯度洗脱的方法，但是会出现一定的基线漂移的现象[8]。实验中选择以等度洗脱为基础，对不同流动相体系（甲醇:0.2%磷酸溶液，乙腈:水，乙腈:磷酸溶液，甲醇:水，甲醇:磷酸溶液，乙腈:甲醇:水等），不同色谱柱（Agela Venusil XBP C18、Agilent ZORBAX SB-C18、Ultimate AQ-C18、Inertsil ODS-3、Eclipse XDB-C18-USP L1、Diamonsil C18等）以及不同的柱温条件（35、30、25、20 ℃）的分离效果进行比较，最后确定采用Agela Venusil XBP C18色谱柱，柱温为30 ℃，甲醇-0.2%磷酸溶液（70:30）等度洗脱，彻底解决了基线漂移的问题，而且能够使Rb1、Rc、Rb2、Fc、Rb3这5种成分达到良好分离，分离度均大于1.5，色谱图见图2。

图2 混合对照品（a）、三七叶总皂苷（b）的HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of mixed reference substance (A),total saponins from the leaves of Panax Notoginseng (B)

2.2.2 线性关系

取系列浓度对照品溶液，按照1.2.2项下色谱条件测定，记录各成分的峰面积。以峰面积A和对照品浓度C(mg/mL)作线性回归，得到线性方程，结果见表3。

表2 三七叶总皂苷HPLC成分分析结果Table 2 HPLC analysis of the components of total saponins from the leaves of Panax Notoginseng

12 人参皂苷F1 42.573 30 人参皂苷C-K 117.633 13 三七皂苷Fe 46.28 31 人参皂苷Rh2 121.27 14 51.567 32 122.657 15 54.94 33 134.757 16 57.073 34 原人参二醇 137.467 17 74.167 35 145.077 18 77.537 36 147.77

表3 人参皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rb3与三七皂苷Fc的线性方程Table 3 Linear equations of ginsenosides Rb1, Rc, Rb2, Rb3 and notoginsenoside Fc

2.2.3 精密度试验

取系列浓度对照品溶液中的任意一份，连续进样5次，测定各成分的峰面积，分别计算RSD值。结果Rb1、Rc、Fc、Rb2、Rb3的RSD值分别为0.64%、1.07%、0.53%、1.69%和1.49%，表明仪器的精密度良好。

2.2.4 稳定性试验

精密称取三七总皂苷，按照1.2.2项下操作，制备样品溶液，分别在0，4，8，12，24，36，48 h内进样，测定各成分的峰面积，分别计算 RSD值。结果Rb1、Rc、Fc、Rb2、Rb3的RSD值分别为1.95%、1.57%、1.41%、1.85%、1.25%，表明样品溶液在48 h内稳定性良好。

2.2.5 重现性试验

精密称取三七叶总皂苷，按照1.2.2项下操作，平行制备6份样品溶液，分别进样，测定各成分的峰面积，分别计算RSD值。结果Rb1、Rc、Fc、Rb2、Rb3的RSD值分别为1.85%、1.15%、1.06%、1.22%、0.73%，表明该含量测定方法重现性良好。

2.2.6 加样回收率试验

精密称取已知含量三七总皂苷样品适量，根据样品中所含Rb1、Rc、Fc、Rb2、Rb3含量的50%、100%、150%，加入各对照品，按照“2.2.3”样品溶液制备项下操作，平行制备9份样品溶液，进样，测定各成分的峰面积，计算加样回收率及RSD值，结果见表4，平均回收率均在99%～101%之间，表明该含量测定方法对于5种成分的准确度较高。

2.2.7 样品测定

按照 1.2.2样品溶液制备项下操作，平行制备 6份样品溶液，测定抗抑郁三七叶总皂苷的主要成分Rb1、Rc、Fc、Rb2、Rb3的含量，结果见表 5。

表4 加样回收率试验结果Table 4 Results of recovery tests

人参皂苷Rc 0.98 0.49 1.48 102.04 99.51±1.33 1.34 1.46 97.96 1.46 97.96 0.98 1.96 100.00 1.96 100.00 1.95 98.98 1.47 2.43 98.64 2.44 99.32 2.46 100.68三七皂苷Fc 0.80 0.40 1.20 100.00 100.09±1.45 1.45 1.22 102.50 1.21 102.50 0.80 1.59 98.75 1.60 100.00 1.59 98.75 1.20 2.00 100.00 1.99 99.17 1.99 99.17人参皂苷Rb2 0.28 0.14 0.41 100.00 100.53±2.24 2.22 0.42 100.00 0.42 100.00 0.28 0.57 103.57 0.57 103.57 0.56 100.00 0.42 0.69 97.62 0.69 97.62 0.71 102.38人参皂苷Rb3 1.56 0.78 2.33 98.72 100.12±1.74 1.74 2.35 101.28 2.33 98.72 1.56 3.11 99.36 3.12 100.00 3.12 100.00 2.34 3.88 99.15 3.89 99.57 4 104.27

表5 三七叶总皂苷5种人参皂苷的含量测定结果（%）Table 5 Content determination of five ginsenosides in total saponins from the leaves of Panax Notoginseng (%)

5 2.41 9.88 7.84 2.85 15.90 38.88 6 2.32 9.85 8.06 2.84 15.81 38.88平均 2.37±0.04 9.78±0.10 7.94±0.08 2.85±0.34 15.73±0.11 38.67±0.18

3 结论

3.1 本课题对抗抑郁作用三七叶总皂苷提取物进行初步的成分分析，从中鉴定出 Rb1、Rc、Fc、Rb2、Rb3等15种人参皂苷成分，其中13种为PPD型人参皂苷。对其中的Rb1、Rc、Fc、Rb2、Rb3这5种代表性PPD型人参皂苷活性成分同时进行含量测定，总含量高达 38.67±0.18%。上述结果表明该活性提取物主要以PPD型人参皂苷为主。我们之前的实验使用硅胶柱层析技术将三七叶总皂苷按照极性的大小切割成三个部位，同时进行抗抑郁活性的对比研究，结果发现富含Rb1、Rc、Fc、Rb2、Rb3的部位活性最强，我们也单独分析了Rb3、Rb1、Rb2等化合物的活性，结果发现上述化合物，尤其是三七叶总皂苷里面含量最高的Rb3(＞10%)具有明显的抗抑郁作用[5,6]。此外其它的文献也报道了Rb3、Rb1、Rc等PPD型化合物的抗抑郁活性[9,10]。我们推测Rb1、Rc、Fc、Rb2、Rb3等PPD型人参皂苷成分是三七叶总皂苷抗抑郁作用的物质基础，应该是多成分协同整合共同发挥抗抑郁作用。

3.2 本研究采用HPLC法对Rb1、Rc、Fc、Rb2、Rb3这5种代表性活性成分同时进行含量测定，该方法准确可靠，可用于抗抑郁作用三七叶总皂苷提取物的质量控制。然而三七叶总皂苷中还有若干的未知成分需要采用HPLC-ESI-MS等方法进一步确定。

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