宫颈癌组织中Toll样受体9和干扰素调节因子7蛋白表达与人乳头状瘤病毒感染的关系

凡尔克·艾合买提江，美力班·吐尔逊，郭文涛，刘恒戈，阿仙姑·哈斯木

(新疆医科大学1研究生学院;2附属肿瘤医院；3基础医学院病理解剖学教研室，乌鲁木齐　830011)

宫颈癌组织中Toll样受体9和干扰素调节因子7蛋白表达与人乳头状瘤病毒感染的关系

凡尔克·艾合买提江1,2，美力班·吐尔逊3，郭文涛1，刘恒戈2，阿仙姑·哈斯木3

(新疆医科大学1研究生学院;2附属肿瘤医院；3基础医学院病理解剖学教研室，乌鲁木齐830011)

摘要：目的探讨子宫颈病变中Toll样受体9(TLR9)和干扰素调节因子7(IRF7)表达与人类乳头状病毒16(HPV16)感染的关系。方法以HPV-GenoCam-9600检测46例宫颈癌，25例高级别鳞状上皮内病变(HSIL)和23例慢性宫颈炎组织HPV感染及分型；采用Illumina Hiseq 4000测序平台对15例宫颈病变组织进行转录组测序；通过免疫组化SP法检测TLR9和IRF7在慢性宫颈炎、HSIL和宫颈癌患者石蜡包埋组织中的表达水平。结果HPV基因芯片分析结果显示，在94例HPV阳性的标本中共检测到11个HPV基因型，在66例宫颈癌及癌前期病变中的10例为多重感染，多重感染率为15.1%(10/66)。3例HPV阳性的慢性宫颈炎组织中都是HPV16阳性。12个HPV基因型中高危型为10个，低危型2个。转录组测序结果显示，HPV16阳性的宫颈癌和HSIL组织中与TLR9相关的差异上调表达的基因有12个；免疫组织化学结果显示TLR9和IRF7在HSIL和宫颈癌组织中高表达，其表达水平呈正相关(P<0.05)，但TLR9在HPV16阳性的宫颈病变组织中表达低于HPV16阴性的宫颈病变组织，且与IRF7蛋白表达呈正相关。结论TLR9和IRF7蛋白参与了子宫颈癌发生发展，但具体调控机制需要深入研究。

关键词：宫颈癌；Toll样受体9；干扰素调节因子7；人乳头状瘤病毒16

中图分类号：R737.33

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2018)05-0539-05

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.004

基金项目：国家自然科学基金(81360332)；新疆维吾尔自治区自然科学基金-联合基金(2017D01C227)

作者简介：凡尔克·艾合买提江(1988-)，男，在读硕士，研究方向：肿瘤分子生物学。

通信作者：阿仙姑·哈斯木，女，博士，教授，博士生导师，研究方向:妇科肿瘤,E-mail:axiangu75@126.com。

本文引用：凡尔克·艾合买提江，美力班·吐尔逊，郭文涛,等.宫颈癌组织中Toll样受体9和干扰素调节因子7蛋白表达与人乳头状瘤病毒感染的关系[J].新疆医科大学学报，2018,41(5):539-542,547.doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.004

RelationshipbetweentheexpressionofTLR9andIRF7proteinsandHPVinfectionincervicalcancer

FanerkeAihemaitijiang1,2,MeilibanTuerxun3,GUOWentao1,LIUHengge2,AxianguHasimu3

(1GraduateSchool;2TheAffiliatedTumorHospital;3DepartmentofPathologyandAnatomy,SchoolofPre-clinicalMedicine,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the relationship between the expression of Toll like receptor 9(TLR9)and interferon regulatory factor 7(IRF7)and human papillomavirus16(HPV16)infection in female cervical lesions.Methods94cases of cervical cancer were detected by hpv-genocam-9600 to diagnose as 46 cased of cervical carcinoma,25 cases of high grade squamous intraepithelial lesions and 23 cases of chronic cervicitis;Illumina Hiseq 4000 sequen HSILg platform was used to sequence the transcriptome of 15 cases of cervical lesions.The expression of TLR9 and IRF7 in the paraffin embedded tissue of chronic cervicitis and cervical cancer was detected by immunohistochemical SP method.ResultsThe results of HPV gene chip analysis showed that 11 HPV genotypes were detected in 86 HPV positive specimens and 10 of 66 cervical cancer and precancerous lesions were multiple infections.The multiple infection rate was 15.10%(10/66).3 cased of HPV positive in chronic cervitis tissues were all HPV16 positive,and 10 of the 12 HPV genotypes were high-risk,and 2 were low-risk.The results of transcriptome sequenHSILg showed that there were 12 differentially expressed genes related to TLR9 in cervical carHSILoma and HSIL.Immunohistochemical results showed that TLR9 and IRF7 were highly expressed in HSIL and cervical cancer tissues,and the correlation between the expression levels of HSIL and IRF7 was positive(P<0.05).However,the expression of TLR9 in HPV16 positive cervical lesions was lower than that in HPV16 negative cervical lesions,and with positive correlation to IRF7 protein.ConclusionThe expression of TLR9 and IRF7 protein may be involved in the occurrence and development of cervical cancer in women.But the specific regulatory mechanisms need to be further studies.

Keywords:cervical cancer;Toll-like receptor 9(TLR9);Interferon regulatory factor 7(IRF7);human papillomavirus 16(HPV16)

Toll样受体(toll like receptor，TLR)及其细胞信号转导机制诱导先天性免疫反应，同时可直接影响后续获得性免疫系统。Toll样受体9(TLR9)在许多肿瘤细胞系和肿瘤中出现表达或者上调表达，与肿瘤的发生、生长和发展密切相关，特别是在上皮来源的肿瘤如胃癌、结肠癌、宫颈癌等恶性肿瘤及癌前病变[1]。干扰素调节因子7(interferon regulatory factor 7，IRF7)是产生 I型干扰素的重要调节因子，具有致癌和抑癌两种特性，其对肿瘤形成的调控与肿瘤细胞的类型密切相关[2]。本研究旨在探讨TLR9和IRF7蛋白在宫颈病变中的表达与HPV感染的关系，为宫颈癌临床诊治提供实验依据。

1　材料与方法

1.1研究对象临床标本选择新疆医科大学第一附属医院2015-2017年慢性宫颈炎、高级别鳞状上皮内病变(HSIL)和宫颈癌患者活检组织标本共94例，全部标本甲醛固定，石蜡包埋。组织病理学诊断由病理医师确诊，其中慢性宫颈炎23例，HSIL25例，宫颈癌46例(高分化鳞癌26例，中低分化鳞癌20例)。采用免疫组织化学方法检测蛋白表达，组织DNA的提取进行HPV芯片检测分型。15例宫颈病变新鲜组织进行转录组测序(分别为正常宫颈HPV阴性、正常宫颈HPV16阳性、HSILHPV16阴性、HSIL HPV16阳性和宫颈癌HPV16阳性组织各3例)。

1.2方法

1.2.1人乳头瘤病毒(HPV)分型基因芯片检测阅读系统(HPV-GenoCam-9600)检测宫颈病变组织按照试剂盒说明书提取组织DNA，并进DNA杂交和显色，用HPV分型基因芯片检测阅读系统对基因芯片检测并分析。结果判断：HPV分型基因芯片检测阅读系统可自动检测INS值(INS的参考值为11.0)，INS<11.0，HPV 阴性；INS≥11.0，HPV 阳性，并报告HPV型别。

1.2.2采用Illumina Hiseq 4000测序平台对宫颈病变组织进行转录组测序提取总RNA和富集mRNA，从组织样品中提取总RNA，利用Nanodrop 2000对所提RNA 的浓度和纯度进行检测。利用带有Oligo(dT)的磁珠与ployA 进行A-T 碱基配对，从总RNA中分离出mRNA，加入fragmentation buffer，可以将mRNA 随机断裂成200bp左右的小片段，并在逆转录酶的作用下，加入六碱基随机引物(random hexamers)，以mRNA 为模板反转合成一链cDNA，随后进行二链合成，形成稳定的双链结构。连接adaptor和Illumina Hiseq 4000上机测序：双链的cDNA 结构为粘性末端，加入End Repair Mix 将其补成平末端，随后在3’末端加上一个A 碱基，用于连接Y 字形的接头，之后Illumina Hiseq测序平台4000 上机测序。

1.2.3采用免疫组织化学法检测TLR9和IRF7蛋白表达情况免疫组织化学SP法检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司产品)，TLR9兔抗人多克隆抗体和IRF7兔抗人多克隆抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司。采用免疫组织化学SP法检测法，切片常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化后微波炉抗原修复，滴加适量H2O2：阻断内源性过氧化物酶，然后滴加一抗(TLR9、IRF7抗体浓度分别为1∶250、1∶500)，4℃冰箱过夜(以PBS作为阴性对照)。第2天加二抗(各步间隔PBS缓冲液冲洗10min)。DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明封片。结果判断采用双盲法由两位病理医师分别观察免疫组织化学结果，以阳性细胞数和染色程度为判断标准。光学显微镜下全视野观察，按阳性细胞数在上皮细胞内所占比例分为4个分值，染色细胞数<5%视为0分，5%～25%为1分，26%～75%为2分；>75%者为3分。染色强度判定：不显色或显色不清为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，深棕色为3分。综合积分按公式计算：综合积分=(染色细胞分数+染色强度分数)/2。

(4)输出重建信号和残差信号。通常情况下，重建信号为原输入信号中的低频分量，残差信号为原输入信号中的高频分量。

2　结果

2.1子宫颈病变中HPV感染和基因型分布在94例女性宫颈病变标本经内参检测后作了HPV的检测，包括46例宫颈癌,25例高级别鳞状上皮内病变(HSIL),23例慢性宫颈炎组织，见表1。

表1　子宫颈癌和HSIL中HPV基因型分布/例

2.2子宫颈病变中与HPV16感染和TLR9相关的差异表达基因前期项目采用Illumina Hiseq测序平台4000完成女性宫颈病变组织的转录组测序，构建Illumina PE文库(200bp)进行2×151bp测序，对获得的测序数据进行质量控制，之后利用生物信息学手段对转录组数据进行分析，HPV16阳性的宫颈癌和HSIL组织中与TLR9相关的差异上调表达的基因有12个，见表2。

2.3TLR9和IRF7在宫颈炎组织、宫颈癌及HSIL组织中的表达及其与临床病理参数之间的关系TLR9蛋白在宫颈炎组织、HSIL组织、宫颈癌组织中阳性表达率分别为34.8%，100%，50%。IRF7蛋白在宫颈炎组织、HSIL组织、宫颈癌组织中阳性表达率分别为47.8%，96%，23.9%，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3，图1。

表2　女性HPV16阳性宫颈癌和HSIL组织中与TLR9相关的差异上调表达的基因

2.4TLR9和IRF7在宫颈炎组织、宫颈癌组织及HSIL组织中的表达水平的相关性Spearman相关分析显示，TLR9蛋白在宫颈病变组织中表达与IRF7表达呈正相关(r=0.373,P<0.05)。

图1　TLR9和IRF7分别在宫颈癌组织、高级别鳞状上皮内病变(HSIL)组织及宫颈炎组织中的表达(×200)

表3TLR9和IRF7在不同宫颈组织中的表达情况/例

分类例数TLR9阳性阴性χ2值P值IRF7阳性阴性χ2值P值宫颈炎组织238151112HSIL组织2525024.5850.00024133.6980.000宫颈癌组织4623231135

3　讨论

宫颈癌的发生与高危型HPV感染密切相关[3]，而且具有族群易感性，提示遗传和环境的交互作用导致的免疫失衡在宫颈癌的发生中发挥关键作用[4]。机体通过免疫应答和免疫监视清除入侵的病原体和恶变组织细胞。近期研究发现，多种肿瘤细胞表面也表达TLRs，并且TLRs信号有助于肿瘤的免疫逃逸和发展,说明各种TLRs的配体特异性可能被肿瘤生存和免疫逃逸所利用[5]。绝大部分TLRs共享MyD88介导的信号转导途径,通过特异性配体的结合，TLRs发生构象变化并被激活，将信号传递给下游效应分子，引起一系列信号传递连锁反应，包括TRAF(s)及其信号转导途径的信号传递，最终诱导各种炎症趋化因子、细胞因子等靶基因表达和引起IRF-3的激活[6]。宫颈癌发生与HPV感染密切相关，那么HPV针对TLRs的配体特异性以及TLRs对天然免疫的介导作用，可能发生一系列防范机制。在我们前期研究工作中发现HPV16编码的E6或E7蛋白对HLA-Ⅰ表达调控产生干扰作用[7]，但是其在TLRs及其天然免疫的影响，还没有直接证据。分布在细胞内体膜上的TLR 9在内体发展成早期溶酶体和成熟溶酶体，此过程的信号转导功能依赖于酸性微环境，而HPV16 E5蛋白能够抑制内体的酸化和成熟过程。说明HPV16也与TLRs信号通路有关。同时HPV16 E5能够引起HLA-Ⅰ在高尔基体滞留，影响其向细胞膜的转运，干扰素(interferons，IFNs)就能够解除这种抑制作用，而IFNs正是TLRs信号转导途径的主要效应产物[8]。由于TLRs信号转导途径对信号转导模块有共享特征和网络复杂性，以及宫颈癌和HPV免疫逃逸和生存策略的多样性，只有通过多种TLRs相关的基因表达调控水平筛查分析，鉴别出宫颈癌特异性TLRs信号通路，才能深入开展TLRs介导的天然免疫与宫颈癌进程的相互作用机制研究，为TLRs特异的宫颈癌免疫治疗和抗肿瘤药物筛选奠定基础。因此，本研究前期采用Illumina Hiseq测序平台4000对子宫颈癌组织进行转录组测序，发现IRF7是与HPV感染相关的TLR9靶基因。

IRF7是产生Ⅰ型干扰素的重要调节因子，其在机体的大部分细胞不表达，但在病毒感染后诱导大量产生[9]。作为TLR9的激动剂CpG-ODN(非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸重复序列)，能识别和激活IRF7、NF-κB等转录因子，调节炎性细胞因子和Ⅰ型干扰素表达，从而产生抗病毒作用[10]。作为TLR9的激动剂非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸重复序列(CpG-ODN)，能识别和激活IRF7、核因子κB(NF-κB)等转录因子，调节炎性细胞因子和Ⅰ型干扰素表达，从而产生抗病毒作用。

研究通过免疫组织化学染色法检测炎症组、HSIL组、宫颈癌组标本共94例，其中宫颈癌组46例，HSIL组25例，宫颈炎症组23例。发现TLR9蛋白的表达从慢性宫颈炎到宫颈癌的发生呈逐渐上升的改变(P<0.05)。由此说明TLR9参与了宫颈癌发生、发展进程。发现IRF7蛋白在宫颈炎组织、HSIL组织、宫颈癌组织中阳性表达率分别为47.8%、96%、23.9%。提示IRF7在宫颈癌组织中相对其他2组对比呈现低表达。对比TLR9与IRF7在这3组的表达情况发现在HSIL组织中TLR9和IRF7表达最高，在宫颈癌组织中TLR9相对IRF7表达较高，2个指标在宫颈癌的恶变过程中表达有差异，这有可能与样本量较小有一定关系。提示TLR9和IRF7表达下调与宫颈组织发生恶性转换有一定的关联性[11]，从而说明通过干预TLR9和IRF7的表达可能预防宫颈组织恶变的作用。也有研究证实，IRF7活性能够促进巨噬细胞的抗肿瘤效应，在乳腺癌和结肠癌细胞的巨噬细胞中，转染具有IRF7组成型活性形式的腺病毒，明显抑制了肿瘤细胞的增殖[12]，而且通过IRF7转染后的巨噬细胞中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等促癌基因表达下调，而抑癌效应分子I型IFN，TRAIL等表达上调，表明IRF7基因可能增强了巨噬细胞的抗肿瘤特性而减弱了其促癌的作用。另外，在原发性乳腺癌患者中，IRF7高表达能够明显延长无骨转移的生存时间；而且在乳腺癌小鼠模型中增强IRF7的表达并不会增加原发肿瘤的增长率，但是过表达IRF7能够明显的减少肿瘤的骨转移[13]。由此进一步说明TLR9和IRF7参于了肿瘤的发生及病变的进展。但由于标本例数的限制以及宫颈癌和HPV免疫逃逸和生存策略的多样性TLR9、IRF7在肿瘤发生发展及宫颈病变过程的具体作用还需要通过扩大样本例数来进一步研究。TLR9、IRF7异常表达在肿瘤细胞组织和不同宫颈组织中，提示可与肿瘤和宫颈病变发生及进展中可能发挥重要作用。

[收稿日期：2018-02-27]

(本文编辑杨晨晨)