银杏叶黄酮苷对副猪嗜血杆菌5型灭活疫苗免疫效力的影响研究

李晓华,邱龙新,林志锋,杨小燕,3

(1.龙岩学院生命科学学院,福建 龙岩 364012;2.福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室,福建 龙岩 364012;3.福建省生猪疫病防控工程研究中心,福建 龙岩 364012)

副猪嗜血杆菌(Hps)主要引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎。剖检具纤维素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等病变表现。副猪嗜血杆菌一共有15个血清型,其中血清4型和5型是中国乃至世界各地较流行的血清型[1]。该病已成为全球养猪业的典型细菌性疾病,其危害日益严重。

近年来,该菌对抗生素的耐药现象日益严重,常用药物对该病已无明显疗效,而且,随着人们对无药物残留、绿色食品需求的期望越来越高,抗生素在本病预防和控制等方面的应用受到严格限制和逐步禁止[2]。因此,接种疫苗已成为预防和控制该病最为有效的方法之一。在副猪嗜血杆菌灭活苗研制中,选用能显著提高体液免疫作用的佐剂对提高疫苗的效力起着重要作用[3]。

银杏(Ginkgo biloba)是世界上最古老的孑遗植物,银杏叶被用作药物已有500余年的历史[4]。近年来,银杏叶及银杏叶提取物(EGB)已广泛应用于禽、猪等生产试验研究。但在有关银杏叶及EGB应用于疫苗中的试验研究尚未见报道。为此,本试验通过EGB中银杏叶黄酮苷对副猪嗜血杆灭活疫苗免疫仔猪外周血T淋巴细胞亚群(CD4+/CD8+)以及血清TFN-α含量影响情况的探讨,旨在为银杏叶黄酮苷在疫苗方面的的开发应用提供依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1试验菌株 副猪嗜血杆菌血清5型 LY02分离株2013年8月分离自龙岩市某发病猪场,由本实验室保存。

1.1.2实验动物 BALB/c小鼠;体重 25 g,购自福建吴氏实验动物有限公司;15日龄仔猪,购自闽西某规模化猪场。猪瘟、蓝耳病抗体水平均合格,伪狂犬病gE抗体检测阴性。

1.1.3试剂 大豆-酪蛋白消化物琼脂培养基(TSA)、胰酪胨大豆肉汤培养基(TSB)、琼脂糖,均购自OXOID公司;烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD),购自北京索莱宝科技有限公司;小牛血清,购自浙江天杭生物科技有限公司;银杏提取物(EGB),购自德国威玛舒培博士药厂(其中,银杏提取物原液每毫升含银杏黄酮苷9.6 mg,萜内酯1.47 mg);TFN-α检测试剂盒,购自上海博谷生物科技有限公司;Hps抗体试剂盒,购自北京飞凯生物技术有限公司。

1.2副猪嗜血杆菌银杏叶黄酮苷佐剂疫苗制备

1.2.1副猪嗜血杆菌菌液的制备 将保存的 LY02分离株复壮后,接种于 TSB液体培养基,37℃180 r/min摇床培养12 h作为种子液,再将种子液按1%体积比接种于另外3瓶TSB培养基中,37℃180 r/min摇床培养 18 h,测 OD600值,计算活菌含量。

1.2.2菌液的灭活 按菌液总体积加入0.4%甲醛,置37℃摇床中灭活,24 h后取灭活菌液于TSA培养基划线培养,检验是否有细菌生长。

1.2.3佐剂疫苗的制备 佐剂疫苗的水相制备:用PBS将灭活菌液充分洗涤3次后离心,用 PBS稀释总菌含量浓度至5.0×109CFU/mL,将不同浓度银杏叶提取物黄酮苷与菌液混合制备为佐剂疫苗水相(见表1)。

佐剂疫苗的油相制备:取白油94份,加入6份司本-80,充分搅拌均匀,高压灭菌121℃、20 min,冷却到室温备用。

佐剂疫苗的乳化:水相与油相按1∶1.5比例乳化,制作成油包水灭活苗,检验物理性状,合格于4℃保存备用。

1.3小鼠佐剂疫苗免疫试验 将50只小鼠随机分为5组,每组10只,分别免疫高、中、低3个浓度银杏叶黄酮苷佐剂疫苗,同时,设立不加佐剂普通多价苗和注射生理盐水阴性对照。首免,分别通过肌肉注射含佐剂灭活菌苗0.2 mL/只,空白对照组注射同等剂量生理盐水,2周后二免,免疫途径和剂量同首免,二免1周后用副猪嗜血杆菌杆菌血清5型强毒株进行攻毒,攻毒方式为腹腔注射菌液0.5 mL/头,活菌含量为 2.0 × 109CFU,连续观察 2周(见表2)。

1.4仔猪佐剂疫苗免疫试验 将25只15日龄仔猪随机分为5组,每组5只,分别通过颈部肌肉注射含佐剂灭活菌苗及不含佐剂普通灭活苗各2mL/头,阴性对照组注射生理盐水,首免14 d后进行二免,免疫途径和剂量同首免,二免后14 d后,用副猪嗜血杆菌杆菌血清5型强毒株进行攻毒,攻毒方式为腹腔注射菌液3 mL/头,活菌含量为7.5×109CFU(见表3)。

表2　副猪嗜血杆菌银杏叶黄酮苷佐剂疫苗小鼠免疫攻毒试验

表3　副猪嗜血杆菌银杏叶黄酮苷佐剂疫苗仔猪免疫攻毒试验

1.5血样采集 分别在28、35、42日龄时采集仔猪前腔静脉血。4 000 r/min离心25 min分离血清,-70℃冷冻保存备用;28、35日龄仔猪采血另一部分用肝素钠作抗凝剂用于T细胞亚群流式检测。

1.6TFN-α水平检测 参照试剂盒使用说明书进行。

1.7T淋巴细胞亚群的检测 按张红英等[8]方法,每管加入经过预试验确定体积的 CD3ε单克隆抗体3 μL、CD4a 2 μL、CD8a 3 μL,然后加入肝素钠抗凝血100 μL,室温避光作用20 min,加入溶血素0.5 mL,室温避光作用10 min,1 500 r/min离心10 min,吸去上清,用PBS洗涤3次后,1%多聚甲醛重悬细胞,进行流式细胞检测。

1.8组织切片的制作与观察 采集攻毒后感染死亡猪和免疫保护猪的肺脏、肝脏、肾脏、心脏等组织,浸泡于10%福尔马林溶液中,按常规方法进行脱水、包埋、切片等处理,制作石蜡组织切片,H.E.染色后显微镜下观察病理变化。

1.9数据分析 采用SPSS 19.0统计学软件进行分析,试验结果以Means±SD表示,当P＜0.05时差异被认为具有统计学意义。

2　结果

2.1实验动物攻毒结果

2.1.1小鼠攻毒结果 小鼠攻毒后4 h小鼠开始出现被毛凌乱、扎堆、颤抖、不进食等临床症状,其中非免对照组最为严重;攻毒后14 h左右部分小鼠开始死亡,未死亡小鼠出现了眼睛发红,有黏性的分泌物,拉稀、呼吸急促、不活动等症状;攻毒后48 h,未死亡小鼠恢复正常活动,眼睛发红、拉稀等症状消失。空白对照组无出现死亡,生理活动正常(见表4)。

表4　小鼠副猪嗜血杆菌5型(Hps)攻毒结果

2.1.2仔猪攻毒结果 阴性对照组:攻毒6 h后出现扎堆、静卧、精神不振等症状,于攻毒29 h后全部死亡;疫苗对照组:攻毒8 h后出现扎堆、静卧、精神不振等症状,于攻毒36 h后全部死亡;高浓度组:攻毒14 h后出现扎堆、静卧、精神不振等症状,攻毒33 h后死亡4头仔猪;中浓度组:攻毒23 h后出现扎堆、静卧、精神不振等症状,攻毒46 h后死亡2头仔猪;低浓度组:攻毒15 h后出现静卧,3 d后精神恢复,全部存活(见表5)。

表5　仔猪副猪嗜血杆菌5型(Hps)攻毒结果

试验组仔猪临床剖检,感染死亡的仔猪普遍出现心包炎、胸腔积液、腹腔积液、关节积液、肺脏纤维素性渗出严重、胸腔粘连等副猪嗜血杆菌感染典型病理变化,而免疫保护组仔猪心、胸腔、腹腔、关节、肺脏均无明显病理变化。

2.2实验动物病理学观察结果

2.2.1感染组仔猪组织学病理变化结果 肺脏表现为间质性肺炎变化,肺泡间质增宽增厚、炎性细胞浸润,肺泡内充满红细胞,肺泡结构缩小甚至消失(见中插彩版图1A);肝细胞水泡变性、细胞核溶解,胞浆淡染,窦状隙扩张,内充满炎性细胞和红细胞,有浆液-纤维素性渗出物(见中插彩版图1B);肾小管上皮细胞脱落管间有出血,肾小球浓缩,肾小囊上皮细胞脱落,细胞核浓缩(见中插彩版图1C);心肌纤维萎缩,部分心肌纤维胞浆溶解、断裂,心肌纤维间有少量炎性细胞和红细胞浸润(见中插彩版图1D)。

2.2.2免疫保护组仔猪的病理学观察结果 免疫保护组仔猪的病理学观察结果,肺脏(见中插彩版图2A),心脏(见中插彩版图2D),肝脏(见中插彩版图2C)和肾脏(见中插彩版图2B)等无明显的病理变化。

2.3副猪嗜血杆菌银杏叶黄酮苷佐剂疫苗免疫仔猪Hps抗体水平的影响 Hps抗体检测结果,攻毒后1周(35日龄),银杏叶黄酮苷中浓度和低浓度组的仔猪血清Hps抗体值均显著高于疫苗对照组(P＜0.05),而高浓度组差异不显著,相对于阴性对照组,添加黄酮苷佐剂中浓度Hps抗体值显著增高(P＜0.01);低浓度组的Hps抗体值差异显著(P＜0.05)(见表6)。

表6　副猪嗜血杆菌银杏叶黄酮苷佐剂疫苗免疫仔猪Hps抗体水平

2.4银杏叶黄酮苷对仔猪血清中TNF-α含量的影响 银杏叶黄酮苷对仔猪血清中TNF-α含量检测结果,二免后1周(28日龄),银杏叶黄酮苷低浓度组的TNF-α含量显著高于疫苗对照组(P＜0.05);攻毒后1周(35日龄),银杏叶黄酮苷低浓度组的TNF-α含量极显著高于疫苗对照组(P＜0.001),高浓度和中浓度组仔猪TNF-α水平显著高于对照组(P＜0.05);攻毒后2周(42日龄),高、中、低3个浓度的TNF-α含量均有显著提高(P＜0.05),以低浓度组提高最显著(P＜0.001)(见表7)。

表7　银杏叶黄酮苷对仔猪血清中TNF-α含量的影响

2.5银杏叶黄酮苷对仔猪外周血T淋巴细胞亚群的影响 银杏叶黄酮苷不同浓度组 CD4+、CD8+含量检测,在二免后1周(28日龄),银杏叶黄酮苷中浓度和低浓度组均可升高外周血中的CD4+淋巴细胞亚群的比例,其中中浓度组显著高于疫苗对照组(P＜0.001),低浓度组显著高于疫苗对照组(P＜0.05);仅有银杏叶黄酮苷高浓度组可升高外周血中的CD8+T淋巴细胞亚群对照疫苗组,效果极显著(P＜0.001),银杏叶黄酮苷佐剂对外周血CD4+/CD8+T淋巴细胞亚群的比例也有明显的提高作用,其中中、低浓度组效果显著(P＜0.05)。在攻毒后1周(35日龄),银杏叶黄酮苷3个浓度组均可升高外周血中的CD4+淋巴细胞亚群的比例,效果都极显著高于疫苗对照组 (P＜0.001),对外周血CD4+/CD8+T淋巴细胞亚群的比例也有明显的提高作用,效果都极显著高于疫苗对照组 (P＜0.001),但对于外周血中CD8+T淋巴细胞亚群比例,均未升高(见表8)。

表8　银杏叶黄酮苷对仔猪CD4+、CD8+、CD4+/CD8+含量变化

3　分析与讨论

3.1本试验研究发现,疫苗中加入银杏叶黄酮苷,能提高仔猪对副猪嗜血杆菌血清5型强毒株的攻毒保护。不同浓度保护率表现各有不同,高浓度组仔猪保护率为20%,中浓度组仔猪保护率为40%,低浓度组仔猪保护率为100%,说明在副猪嗜血杆菌疫苗中添加一定浓度的银杏叶黄酮苷可提高保护率,以低浓度(1.4 mg/mL)添加量,保护效果最好。

3.2体液免疫是B细胞介导的一种重要的免疫反应,血清中抗体水平为评估其免疫状况的重要指标之一。EGB能促进抗体的生成,增强机体的体液免疫功能[5]。黄其春、杨小燕[6]等对银杏叶提取物调节断奶仔猪免疫功能的研究发现,EGB能增强红细胞免疫功能、淋巴细胞活性及腹腔巨噬细胞的吞噬能力,能够增强断奶仔猪的体液免疫功能。对实验仔猪在35日龄(攻毒后1周)采血检测血清中Hps抗体水平。结果表明,银杏叶黄酮苷中、低浓度组的仔猪血清Hps抗体值均显著高于对照组(P＜0.05),而高浓度组差异不显著,说明中、低浓度银杏叶黄酮苷与Hps菌株灭活苗配合使用,能显著提高疫苗免疫效力。

3.3TNF-α主要是由巨噬细胞分泌的一种细胞因子,在炎症反应和免疫反应中起着重要作用。王国栋[7]等发现银杏叶提取物对大鼠肝脏来源的Kc的TNF-α及其蛋白质表达呈浓度依赖性,随着银杏叶提取物的浓度的增加,TNF-α mRNA及其蛋白质表达逐渐减少,本试验对银杏叶黄酮苷不同浓度组TNF-α含量检测结果显示,各日龄中,二免后1周(28日龄)检测结果,以低浓度组TNF-α含量显著高于对照组,攻毒后1周(35日龄)和攻毒后2周(42日龄)检测结果,低浓度组TNF-α含量极显著高于对照组,高、中浓度组显著高于对照组。

3.4细胞免疫是T淋巴细胞介导的机体另一种重要的免疫反应,通过检测动物T淋巴细胞数目,可以了解动物机体的细胞免疫状况[8]。EGB能增加T淋巴细胞的数量,调节T淋巴细胞亚群的平衡,对细胞免疫具有促进作用。CD 4+亚群是辅助性T淋巴细胞(Th/Ti)的标志。这两类细胞都直接参与特异性细胞免疫反应,而且Th/Ti细胞对细胞免疫反应起激发调控作用[9]。郝璐(2016)[10]等通过银杏叶提取物对小鼠脾淋巴细胞体外增殖和分泌功能的影响研究发现,EGB在一定剂量范围内能够促进小鼠脾淋巴细胞增殖,能提高脾淋巴细胞CD4+/CD8+的比值。本试验通过对银杏叶黄酮苷不同浓度组CD4+、CD8+含量检测,结果表明,在二免及攻毒后1周,在副猪嗜血杆菌疫苗中添加一定浓度的银杏叶黄酮苷,可升高外周血中的 CD4+T淋巴细胞亚群的比例,对外周血CD4+/CD8+T淋巴细胞亚群的比例也有明显的提高作用,但对于外周血中CD8+T淋巴细胞亚群的比例,均未升高。熊平源等(2012)[11]采用间接免疫荧光法测定EGB对小鼠CD4+/CD8+T淋巴细胞亚群的影响,结果发现EGB能降低CD4-CD8+的百分率,呈反向调节作用。在本试验中EGB对CD8+是否也呈现反向调节作用,有待进一步开展研究。