经寰枕间隙侧方穿刺移植人脐血单个核细胞对难治性神经系统疾病的疗效分析

于海燕 宫殿荣 袁晓玲 刘力峰 赵敏 王敏 芦倩

细胞移植治疗神经系统疾病与损伤，特别是难治性神经系统疾病是近些年新兴的极具潜力及研究意义的生物治疗方案，已有许多研究及报道从各方面说明细胞移植具有神经保护、神经修复、改善脑内环境及调节免疫等作用，但这些研究多见于动物实验，近几年细胞移植的临床研究逐渐开展起来，且移植方法多样，包括静脉注射、侧脑室穿刺、腰椎穿刺和立体定向技术等。临床上任何治疗手段的前提是安全，选择合适的细胞种类和移植途径，保证细胞移植的可行性和安全性，在此前提下，才能研究探讨疗效。2017年10月，美国FDA批准了脐血细胞疗法扩大临床范围，包括脑瘫、自闭症、脑缺血等，为更多神经系统疾患提供研究性脐血疗法。团队应用寰枕间隙侧方穿刺术[1-2]向枕大池内移植人脐血单个核细胞（human umbilical cord blood mononuclear cells，hUCB-MNC），对230例难治性神经系统疾病患者进行了450次hUCB-MNC治疗，现报道如下。

资料与方法

一、病例资料

选取聊城市人民医院神经内科2011年7月至2016年4月共230例难治性神经系统疾病（12种疾病）患者，进行寰枕间隙侧方穿刺术移植hUCBMNC治疗450次，男137例，女93例，年龄9 ～ 84岁（表1）。hUCB-MNC由聊城市人民医院干细胞临床研究实验室提供，脐血由聊城市人民医院妇产科提供。

纳入标准：（1）符合相关疾病临床诊断标准；（2）患者或家属能够配合检查和治疗过程并签署知情同意书；（3）随访合作信息无丢失者。

排除标准：（1）恶性肿瘤患者；（2）活动性结核患者或存在严重的感染性疾患未被控制者；（3）心、肝、肾或其他脏器严重的器质性疾病患者；（4）精神疾病患者；（5）严重的血液疾病或凝血功能障碍者；（6）过敏体质者。

表1 寰枕间隙侧方穿刺hUCB-MNC移植病种、病例数及穿刺次数

二、方法

（一）治疗前检查

1.安全性指标检查：血常规+血沉、生化全项、全身肿瘤标记物、病毒筛查、出凝血机制、胸部正侧位X线片。

2.疗效性检查：颅脑MR、肌电图、脑脊液化验等根据不同病种各自完善。

（二）获取脐血单个核细胞

脐血检测示乙肝七项、HCV、HIV、梅毒等其它相关传染性指标均呈阴性，无伦理问题。干细胞实验室专业人员用脐带血细胞体外分离试剂盒（加拿大威尔森公司研制，宁夏中联达生物有限公司生产，规格：SCR-200I）使用说明书进行操作，去除所有的红细胞、血小板、血浆和粒细胞，保留几乎所有的单个核细胞，获得5 ml hUCB-MNC悬液，行细胞质量检测：包括细胞计数、CD系统检测、细菌培养、内毒素检测等。hUCB-MNC终制品细胞活性≥95﹪，细胞收集计数为（2 ～ 3）×108个，纯度≥98﹪。

（三）寰枕间隙侧方穿刺术移植hUCB-MNC

患者或其委托人知情同意，并签署细胞治疗知情同意书和寰枕间隙侧方穿刺术知情同意书。患者去枕仰卧，标记穿刺点。常规消毒铺洞巾，利多卡因逐层局部麻醉后，行寰枕间隙侧方穿刺术，缓慢将 5 ml hUCB-MNC 悬液计数为（2 ～ 3）×108个导入枕大池内，并置换等量脑脊液。操作过程严格遵循无菌原则，术后患者去枕卧位8 h。接受≥2次治疗的患者，治疗间隔时间一般为28 d，自第1次治疗后开始计算随访时间。

表2 部分检验指标治疗前与治疗后3个月对比

表3 患者经寰枕间隙侧方穿刺hUCB-MNC移植治疗后疗效比较（n）

（四）观察指标

治疗全程及治疗后24 h内严密观察患者一般情况及生命体征（T、P、R、Bp）。观察患者有无穿刺点出血、局部血肿、头痛、头晕等。每位患者分别在治疗前，治疗后3个月在我院进行血样检测（血常规+血沉、生化全项、全身肿瘤标记物、病毒筛查、出凝血机制）。检测前提为患者无感染、无合并严重的其他脏器疾病等。

三、统计学分析方法

应用 SPSS 13.0 统计学软件进行统计学分析，治疗前后患者血常规+血沉、生化全项、全身肿瘤标记物、病毒筛查和出凝血机制结果以± s表示，治疗前后化验指标比较采用配对t检验，以P＜ 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、不良反应

230例患者共进行了450次细胞治疗，有32例在治疗后6 h内出现一过性血压升高，最高者180/110 mmHg（1 mmHg = 0.133 kPa），发 生 率7.1﹪，对症治疗及心理疏导后于24 h内血压恢复基线水平，考虑与患者紧张情绪有关。有8例治疗后12 h内出现发热，体温37.3 ℃～ 38.5 ℃，发生率1.8﹪，予对症降温治疗后体温恢复正常，无反复。10例穿刺时诉穿刺处深部软组织胀痛，拔针后疼痛消失，发生率2.2﹪。所有患者治疗后均无头痛、感染、血肿形成、反复发热、皮疹、抽搐等不良反应和其它移植并发症出现。

二、血液学指标

患者血常规+血沉、生化全项、全身肿瘤标记物、病毒筛查、出凝血机制在治疗前后无明显差异（表 2）。

三、疗效

有183例患者在治疗后出现病情改善，并在随访时间内持续好转，部分痊愈，有效率79.6﹪（表3）。

讨 论

某些难治性神经系统疾病如变性疾病（阿尔茨海默氏病、多系统萎缩、帕金森、运动神经元病和一氧化碳中毒迟发性脑病等）、脑血管病后遗症、神经系统脱髓鞘疾病等，用传统的治疗方法疗效差甚至无效。而细胞移植因其特殊的生物学功能，为难治性神经系统疾病的治愈提供了可能性。其中脐血作为最丰富的细胞库，在临床的应用早已不限于血液系统疾病，其衍生的hUCB-MNC更具有以下优越性[3-4]：（1）采集、分离方法简便，无创伤，无伦理学争议；（2）因其免疫系统的原始性，抗原性极低，相对安全；（3）有较强的增殖、分化能力，寿命更长。

hUCB-MNC为混合细胞群，含有几种类型的干细胞、内皮祖细胞，调控T细胞、自然杀伤细胞、T淋巴细胞和树突状细胞等，这些细胞在神经系统退行性疾病发生发展过程中有积极的保护作用[5]。人脐血细胞含有高水平的CD34+和CD105+细胞标记，标志着其有较高的再生潜力[6]，研究也发现hUCBMNC具备较高的分化潜能，能在特定环境的诱导下向多个方向分化[7-9]，其脑内移植可存活并能减轻脑损伤[10]，hUCB-MNC移植入脑内后，不仅可分泌神经生长因子[11-13]，还能促进内源性神经因子释放[14]，保护神经和修复神经损伤，重建再生微环境。还有研究表明hUCB-MNC能够通过调节免疫机制而在神经系统疾病中起到治疗作用[15-17]。团队的临床观察也证明hUCB-MNC治疗对难治性神经系统疾病如一氧化碳中毒迟发性脑病、多系统萎缩等有治疗作用，并且安全可靠，无明显不良反应和致瘤性[18-21]。

宫殿荣教授独创的寰枕间隙侧方穿刺术，以往也曾称为“枕大池侧方穿刺法”[1]，经过20余年的临床检验，证实非常安全可靠[2]，自2011年起，团队将寰枕间隙侧方穿刺术与hUCB-MNC移植结合，从寰枕间隙侧方进针，将细胞直接导入枕大池内。

目前神经系统疾病的细胞移植途径主要有静脉注射、侧脑室穿刺、腰椎穿刺、立体定向移植等途径。对比以上几种途径，寰枕间隙侧方穿刺术用于hUCB-MNC移植有以下优点：首先，寰枕间隙侧方穿刺术将hUCB-MNC直接导入枕大池，与病灶更接近，避免了细胞经静脉移植途径中经过循环和组织器官的消耗，也避免了移植的细胞是否能通过血脑屏障这一尚不明确的问题[22]；其次，枕大池与第四脑室直接相通，目前侧脑室穿刺法移植的干细胞已被证实可以特异性的迁移至脑损伤区域，并与宿主细胞在形态和功能上形成良好的整合[23]，所以寰枕间隙侧方穿刺移植hUCB-MNC即可以达到侧脑室穿刺同等的效果，又能减少创伤和并发症；对比腰椎穿刺[24]，寰枕间隙侧方穿刺术操作时不须摆放特殊体位，适合于任何需要留取脑脊液检查或椎管内注入药物的患者，尤其是病情严重不能随意摆放体位、或气管插管、意识障碍，肌张力过高的患者，而且腰穿注射的细胞随脑脊液被动循环行程较长，细胞在各神经根处有不可避免的消耗、丢失，而寰枕间隙侧方就可弥补这一问题；立体定向移植技术可以直接将细胞注入病变部位或周围，多适用于病变部位明确和局限的疾病如脑血管病、帕金森氏病等，但是对于一些病变部位广泛弥漫的疾病如迟发性脑病、多系统萎缩等，该技术的适应症要窄一些，所以寰枕间隙侧方穿刺术可以作为一种可行的替补方法。所以综合以上，寰枕间隙侧方穿刺术具有成功率高、适应症广、创伤小、疗效好等优点[25]，可以作为细胞移植治疗神经系统疾病的首选或替代途径。

本研究利用寰枕间隙侧方穿刺移植hUCBMNC对230例患者进行450次注射治疗，均未发现任何相关的严重不良反应和并发症，血液学检查及基本生命体征均无明显变化，说明经寰枕间隙侧方穿刺移植hUCB-MNC方法是安全可行的。

本研究应用hUCB-MNC移植治疗10余种疾病，其中以一氧化碳中毒迟发性脑病、多系统萎缩、脑血管病、运动神经元病为多，随访发现多数患者病情好转，部分痊愈。并且发现接受治疗越早，疗效越好。大部分迟发性脑病患者在接受1 ～ 3次治疗后，病情明显好转，甚至痊愈，多系统萎缩、运动神经元病、脑血管病后遗症者平均接受3 ～ 4次治疗，有2例多系统萎缩患者，在治疗后3 d内病情即明显好转[19-21]。在以后的临床研究中会继续深化、细化，针对不同疾病完善试验设计、增加对照组、量化试验结果、完善随访计划和评价方法等，以寻找最佳治疗时间窗、治疗周期和有效的细胞数量，同时结合临床前基础研究，为细胞在提供更有力的理论支撑。

细胞移植技术为目前用传统方法难以见效的神经系统疾病的治疗带来了希望，也成为目前国内外研究的热点，细胞治疗的种类和移植方法的多样性也给此类研究带来了多向选择性。目前细胞移植最受关注的还是临床安全性这个前提，通过230 例临床样本的研究，对寰枕间隙侧方穿刺术hUCBMNC移植的安全性进行了系统的评价，提示该技术是治疗神经系统疾病的一个很好的值得推广的方法，期望本文能为细胞移植的安全性提供参考和依据，也能为细胞移植的临床应用带来新的思路。

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