定向激活HIF-1协同脂肪干细胞对糖尿病小鼠皮肤创伤修复的促进作用

杜俊凯 陈明月 徐之超 白立曦 段鹏

伤口愈合是一个高度复杂的生物过程，由三个重叠的阶段组成：炎症、增殖和重塑。任何一个或多个阶段的损伤都会导致修复障碍[1]。伤口愈合过程需要对受损组织区域的细胞和非细胞成分进行空间和时间重排。缺氧是组织损伤和创面愈合的主要微环境因素之一[2]。炎症阶段的特征是血管反应和炎症细胞的招募。最初的组织损伤诱导血管损伤从而导致急性组织缺氧。通过浸润的炎性和基质细胞增加氧消耗，进一步降低组织氧张力最终导致长期慢性组织缺氧[3]。此外，间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在正常伤口愈合的炎症、增殖和重建阶段起着重要的作用[4]。由于一些因素可导致伤口很难愈合，故创伤与修复是外科临床治疗中要面对的棘手问题。随着现代医学的发展，对于创伤修复已不仅仅停留于外科操作本身，而是将目光逐渐聚集到伤口愈合的细胞和分子机制。

低氧反应，主要是由氧稳态的主要转录因子低氧诱导因子 -1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）介导的，在几乎所有的伤口愈合和重塑过程中都被证明是至关重要的[3]。HIF-1是1992年Semenza等[5]发现的一种氧依赖转录激活因子，通过与低氧反应元件结合，调控下游基因的转录。研究发现，在正常皮肤伤口中，HIF-1对增强适当的炎症和血管生成反应极其重要[1]。在影响组织创伤修复的众多因素中，组织再生的干细胞来源不足、促愈合的细胞因子缺乏及血管化减少是关键的[6]。多潜能间充质基质细胞（又称MSCs）是一种细胞疗法的热门工具，不仅因其多功能性质，也因其能植入受损组织，释放营养物质，促进新血管形成，调节氧化应激和诱导抗炎反应[7]。一些临床前和临床研究已证实MSCs的移植可以改善伤口愈合[8-9]。脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ASCs）是来源于脂肪组织的MSCs，具有自我更新及多向分化的干细胞特性。糖尿病是一种与伤口愈合有关的全身慢性代谢疾病[10]。本研究拟建立糖尿病小鼠创面损伤模型，探讨HIF-1协调脂肪干细胞对糖尿病小鼠皮肤损伤修复的作用及机制。

材料与方法

一、材料

（一）实验动物

8周龄雄性SPF级C57BJ/L小鼠68只，体质量在 16.0 ～ 21.4 g，平均（19.8±1.4）g，购于南京大学生物医药研究院[SCXK（苏）2015-0001]。

（二）细胞来源

从吸脂术后的脂肪组织中提取ASCs。脂肪组织均来源于西安交通大学第一附属医院整形外科门诊行腹部吸脂术的健康成年女性（获得患者知情同意），共6名，平均年龄28周岁。

（三）实验试剂

质粒 gWIZ-CA5-HIF-1α（CA5-HIF-1α）、gWIZ-empty vector（EV）、gWIZ-KGF（KGF）均由美国林肯公司提供。逆转录试剂盒和SYBR PremixEx Taq试剂盒均来源于日本TaKaRa公司。

二、实验方法

（一）糖尿病慢性创面模型制备

C57BJ/L小鼠适应饲养环境1周。禁食8 h后，测定小鼠空腹血糖正常，然后腹腔注射1﹪链脲佐菌素（STZ，60 mg/kg）的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH值 = 4.0）。注射3 d后，于清晨空腹抽取尾静脉血，空腹血糖浓度＞ 16.7 mmol/L则被视为成功建立了糖尿病小鼠模型，用于后续实验。将糖尿病小鼠背部皮毛剔掉，用无菌打孔器在背部中线两侧间距1 cm以上各做直径为1 cm的圆形皮肤全层创口，形成皮肤缺损创面。使用数码相机拍摄小鼠伤口。采用图像分析软件Photoshop对糖尿病小伤口图像予以处理、分析以及计算。在治疗后第14天随机选取各组小鼠3只处死,将创面标本切分成两半，一半用于后期提取总RNA，另一半用于后期提取蛋白，并放于液氮冻存。

（二）质粒注射和电穿孔基因转染

本实验采用定向激活的HIF-1，可以在常氧状态下保持其转录因子活性。这种被称为CA5-HIF-1α的定向激活的HIF-1（图1）其包含了392 ～ 520氨基酸编码区域的缺失和P567T、P658Q部位的错义突变，使得HIF-1α能在富氧环境中保持稳定。从而提高了其在创伤局部的表达水平，增加其生物学活性，促进血管生成。将溶于50 μl生理盐水中的质粒DNA注射入伤口两侧的有两个点位置，立即用纱布包住皮上伤口。紧接着，在皮内DNA分布的位点插入4个穿透性电极。电极阵列包括四个穿透电极，排列成两个相邻的等腰三角形，间距为2.5 mm，插入深度为2 mm。电极插入后以振幅为330 Vcm-1的电极间距给予电刺激。刺激的总持续时间为40 ms，间隔时间为400 ms。电脉冲刺激完成后，从创面组织中取出电穿孔装置，将其转移至恢复。

图1 CA5-HIF-1α示意图

（三）ASCs体外分离、培养和扩增

脂肪抽吸物经磷酸盐缓冲液清洗3遍后，在37 ℃，用0.075﹪的Ⅰ型胶原酶消化，120×g离心60 min。用浓度为10﹪FBS的DMEM培养液使消化终止，然后，1200×g离心10 min，得到高浓度同质组织细胞团，再用红细胞裂解液处理5 min，去掉掺杂的红细胞，过直径100 μm的蹄网去掉没有完全消化的组织。所得到的细胞接着用完全培养基进行常规培养。当细胞生长融合度约为70﹪～ 80﹪时以1 : 3的比例进行传代。选择第三代细胞用于所有实验。在创伤后的48 h内，对每一受体小鼠给予含2×106个细胞悬液的生理盐水。

（四）实验分组

将糖尿病小鼠随机分为空载质粒（EV）组，CA5-HIF-1α 转 染（CA5）组，EV+saline组，CA5+saline组，EV+ASCs组，CA5+ASCs组。

（五）创伤愈合面积的的观察

在 治 疗 后 第 0、3、7、10、14、17 和 21 天，使用透明醋酸纸描记创面大小并用图像分析软件Photoshop计算伤口面积（以像素计算）。创面形成后当天（第0天）的伤口面积被取为100﹪，并每天完整记录伤口愈合情况。

（六）激光多普勒血流成像检测血流灌注情况

使用激光波长是785 nm的氦氖激光扫描多普勒成像设备（LDI2-IR，moor instruments，Devon，UK）检测伤口区域的血流量，该设备利用一个近红外激光二极管来测量皮下血液流动，这基于多普勒频仪散射光可检测血细胞的运动。成像系统采用低功耗（2 mW）的红外激光对组织进行顺序扫描。对于每一个测量点，都会产生一个与组织灌注线性相关的信号。在第7、10、14和17天对含整个创伤面积的区域进行了一系列测量，扫描头高度在20 cm处扫描。记录所测量部位数值取其平均值，单位是灌注指数（perfusion unit，PU），并使用软件包Moor LDI V5.2软件计算平均血流。

（七）HE染色检测血管密度

在治疗14 d后，处死小鼠，对创面进行组织学分析。剪取创面以及创面周缘10 mm左右的全层皮肤。4﹪多聚甲醛固定后，常规切片。然后，进行苏木素伊红染色。用荧光显微镜观察新生微血管密度情况并拍照。

（八）荧光定量PCR法检测HIF-1α及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）mRNA表达

用Trizol提取创伤组织总RNA并测算浓度，再根据逆转录试剂盒说明书操作将RNA合成cDNA，按照SYBR PremixEx Taq试剂盒说明书以cDNA作为模板进行PCR反应并运用LightCycler 480仪器检测目的基因表达。以GAPDH基因为内参基因，采用 2-ΔΔCt法进行结果分析（表 1）。

表1 HIF-1α、VEGF、GAPDH 基因的引物

（九）Western blot法检测VEGF蛋白表达

按照试剂说明书提取并收集各组小鼠创伤组织的蛋白，然后运用BCA蛋白定量试剂盒测定并计算蛋白浓度，再进行聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳。电泳完成后，经湿转法转膜（250 mA，120 min）。接下来，使用封闭液将PVDF膜进行封闭。再用一抗稀释液（anti-VEGF、1 : 1000；anti-GAPDH、1 : 1000）于 4 ℃摇床过夜孵育 PVDF膜。次日，用含0.1﹪吐温的TBST于摇床上洗膜3次，每次10 min。二抗稀释液室温孵育1 h后，再用含0.1﹪吐温的TBST于摇床上洗膜3次，每次10 min。最后，用成像仪拍照。用GAPDH作为内参，并进行3次重复实验。

三、统计学分析方法

采用SPSS18.0统计学软件，本研究的伤口面积、创面血流量、HIF-1α和VEGF mRNA、VEGF蛋白水平实验数据以± s表示，用 Bonferroni或Tukey post hoc分析法对组间伤口面积、创面血流量、HIF-1α mRNA及VEGF mRNA及蛋白水平进行单因素方差分析。以P＜ 0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1.CA5-HIF-1α基因注射剂量的选择：使用电穿孔基因转染将不同剂量CA5-HIF-1α基因（50，125，250 μg）注射糖尿病小鼠创伤局部后，PCR检测HIF-1α mRNA表达水平，以选择最优的注射剂量。随着注射剂量的不断增加，局部HIF-1α mRNA表达水平在一定范围内与剂量成正相关，但高剂量（250 μg）组局部目的基因水平却有所减低，且CA5-HIF-1α 基因注射剂量为 125 μg时，局部 HIF- 1α mRNA 表 达 水平较高（10.40±0.22）（F= 19.48，P= 0.025），故本研究选择125 μg的剂量进行后续的研究（图 2）。

2.定向激活HIF-1基因促进糖尿病小鼠皮肤创伤修复：角化细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF）是创伤修复中重要细胞因子[11]，为评估定向激活HIF-1在创伤修复中的效率，本研究使用相同质粒载体（gWIZ）、相同浓度（125 μg/ 50 μl）的 KGF 基 因 和 CA5-HIF-1α 基 因对糖尿病小鼠皮肤创伤模型进行基因治疗，结合电刺激。结果显示，于给药后第 3、7、10、14天，CA5-HIF-1α基因治疗组小鼠的伤口面积小于空载对照组（F= 41.37、32.16、27.29、25.16，P= 0.028、0.034、0.038、0.042），并优于 KGF组，且在17 d各组小鼠伤口基本愈合（表2）。

图2 不同处 理组小鼠HIF-1α mRNA表达水平的比较

图3 CA5-HIF-1α基因治疗组（CA5组）与空白对照组（EV组）小鼠创面血流量比较

3.定向激活HIF-1基因增加糖尿病小鼠创面血流量：为了探讨定向激活HIF-1基因对糖尿病小鼠创面组织灌注的作用，本研究使用无创的LDPI检测皮肤血流。于CA5-HIF-1α基因治疗后的第7、10、14、17天评估伤口的血流情况。CA5-HIF-1α基因治疗组小鼠伤口灌注于第10天增加，治疗后第14天空白对照组和基因治疗组的皮肤血流均达到最大值，且第10天和第17天基因治疗组小鼠的皮肤血流（253.06±8.34、250.59±10.13）均大于空白对 照 组（158.31±9.98、169.73±7.28）（F=21.53、26.08，P=0.038、0.032，图 3）。

4.HIF-1α基因联合ASCs治疗促进糖尿病小鼠皮肤创伤修复：研究发现，ASCs具有促进创面愈合作用[12]。于是，本研究进一步探讨了HIF-1α基因联合ASCs治疗对糖尿病小鼠皮肤创伤修复的影响。结果显示，在治疗后3 ～ 14 d，HIF- 1α基因单独治疗、ASCs单独治疗及二者联合组的伤口面积小于对照组（F= 39.58、44.09、34.67，P=0.031、0.028、0.037），且 HIF-1α 基因和 ASCs联合治疗组的伤口面积最小，提示联合治疗的效果最优（表 3）。

5.HIF-1α基因联合ASCs治疗增加糖尿病小鼠创面血流量：本研究还观察了HIF-1α基因联合ASCs治疗对糖尿病小鼠创面组织灌注的影响。在治疗后的第7、10、14、17天使用无创的激光多普勒血流成像评估伤口的血流情况。本研究还发现HIF-1α基因单独治疗、ASCs单独治疗及二者联合组的皮肤血流于第10天增加，且ASCs联合治疗组血流增加幅度最大，于第14天，所有糖尿病小鼠的皮肤血流均达到最大值，且第10天和第17天HIF-1α 基 因 单 独 治 疗（262.05±9.34、248.45±11.13）、ASCs单 独 治 疗（215.33±10.75、185.82±10.47）及 二 者 联 合 组（322.54±12.27、292.49±9.57）小鼠的皮肤血流均大于空白对照组（161.30±5.64、134.57±8.67）（F= 29.15、17.38，P= 0.026、0.034,图 4）。

表2 不同处理组经定向激活HIF-1基因治疗后糖尿病小鼠伤口面积的比较（像素，± s）

表2 不同处理组经定向激活HIF-1基因治疗后糖尿病小鼠伤口面积的比较（像素，± s）

注：与同一时期的EV组比较，*P ＜ 0.05

治疗后时间第0天 第3天 第7天 第10天 第14天 第17天 第21天EV 组 9 125.48±117.53 9 062.00±225.75 8 534.42±189.35 5 634.59±198.06 2 308.15±245.36 462.42±22.61 12.65±0.03 KGF 组 8 962.06±184.37* 8 351.02±164.56* 7 724.10±205.61* 4 396.48±175.69* 1 785.17±231.58* 198.13±14.02* 13.26±0.02*CA5 组 9 067.26±247.03* 7 828.92±294.28* 7 285.97±118.24* 4 050.41±301.97* 1 292.35±101.14* 69.61±18.57* 9.25±0.25*F值 39.25 41.37 32.16 27.29 25.16 45.49 28.17 P值 0.031 0.028 0.034 0.038 0.042 0.024 0.037分组

表3 不同处理组经HIF-1α基因联合ASCs治疗后糖尿病小鼠伤口面积的比较（像素± s）

表3 不同处理组经HIF-1α基因联合ASCs治疗后糖尿病小鼠伤口面积的比较（像素± s）

注：与同一时期的EV+Saline组比较，*P ＜ 0.05

治疗后时间第0天 第3天 第7天 第10天 第14天 第17天 第21天EV+Saline 9 080.12±120.41 8 989.25±175.03 8 320.72±176.05 5 590.61±208.28 2 473.08±163.82 405.76±16.78 42.13±0.05 CA5+Saline 9 117.46±241.58* 7 656.92±177.03* 7 163.83±128.24* 4 238.23±228.36* 1 316.52± 90.75*186.36±17.95* 26.08±0.13*EV+ASCs 9 134.50±254.33* 7 593.64±192.12* 7 233.08±146.86* 4 097.58±227.91*1 488.53± 86.25*160.48±18.72* 31.45±0.28*CA5+ASCs 8 994.27±184.72* 6 745.25±203.16* 6 159.35±168.72* 3 682.06±257.30* 997.64±183.71*108.67±10.58* 19.25±0.36*F值 27.15 39.58 44.09 34.67 29.52 35.05 31.68 P值 0.046 0.031 0.028 0.037 0.043 0.035 0.041分组

6.HIF-1α基因联合ASCs治疗增加糖尿病小鼠血管密度：本研究也探讨了HIF-1α基因联合ASCs治疗对糖尿病小鼠创面血管密度的影响。HE染色结果显示，HIF-1α基因单独治疗、ASCs单独治疗及其联合治疗后，糖尿病小鼠创面的血管密度明显增加，且联合治疗后的小鼠血管密度增加最明显（图 5）。

图4 不同处理组小鼠创面血流量比较

图5 荧光显微镜下观察各组小鼠皮肤创面的血管密度（HE染色 ×50）

7.HIF-1α基因联合ASCs治疗诱导糖尿病小鼠VEGF mRNA及蛋白表达上调：为进一步探讨HIF-1α基因联合ASCs治疗对糖尿病小鼠皮肤创伤修复的作用机制，本研究采用荧光定量PCR法和Western blot方法分别对治疗后14 d的糖尿病小鼠创面组织VEGF mRNA及蛋白水平进行检测。HIF-1α基因单独治疗、ASCs单独治疗及二者联合治疗组VEGF mRNA及蛋白表达水平分别为2.03±0.14、2.16±0.13、3.41±0.18 和 1.75±0.12、1.82±0.06、2.96±0.14高 于 对 照 组（1.05±0.02、1.03±0.05）（F= 34.08、29.53，P= 0.019、0.021），且联合治疗组VEGF mRNA及蛋白表达水平最高，提示HIF-1α基因及ASCs治疗对糖尿病小鼠皮肤创伤修复的作用可能与其上调VEGF蛋白的表达水平有关（图 6、7）。

图6 不同处理组小鼠的VEGF表达水平的比较

图7 不同处理组小鼠VEGF蛋白表达Western blot 检测

讨 论

糖尿病患者的伤口愈合受损（例如糖尿病足溃疡）是全球主要的医疗和公共卫生问题之一。超过50﹪的非创伤性下肢截肢是由糖尿病的伤口溃疡引起的。此外，患有足部溃疡的糖尿病患者预后较差，死亡率也更高[13]。目前还没有有效的治疗策略，主要原因是导致伤口修复失败的分子发病机制尚未得到充分的了解。

HIF-1是一种核转录因子，在哺乳动物的生长发育、生理和病理反应过程中举足轻重。

研究报道，激活HIF-1基因能够减少遗传性糖尿病小鼠的伤口愈合时间[14]。那么，激活HIF-1基因能否改善STZ诱导的慢性糖尿病小鼠的创伤修复呢。HIF-1是细胞内持续性表达的蛋白,在正常氧浓度条件下，细胞内HIF-1不稳定，半衰期不到10 min，很快通过氧依赖降解结构域介导的泛素蛋白酶体降解，而失去生物学活性[15]。为了让HIF-1α在非缺氧环境下持续发挥生物学活性，起到高效、持久的促血管生成作用，本研究使用CA5-HIF-1α的定向激活的HIF-1，它能在富氧环境中保持稳定。本研究结果显示，CA5-HIF-1α质粒注射到糖尿病小鼠后，能够减少伤口面积和促进创面血流量，进而加速创面愈合，这与Zhang等[16]报道的激活HIF-1基因能够促进糖尿病小鼠的伤口愈合相一致。

ASCs是一种MSCs，由于相对于其他组织的MSCs，其相对丰富的脂肪组织及其可获取性，表现出一定的治疗潜力。Kato等[12]发现，ASCs移植可促进Zucker糖尿病大鼠的创面愈合。基于此经验，本研究接着探讨联合HIF-1α基因治疗/ASCs细胞治疗方法对糖尿病小鼠创面愈合的影响。本研究发现，HIF-1α基因治疗和ASCs细胞治疗联合治疗糖尿病小鼠可加速创面愈合以及增加创面血流量和血管密度，且联合治疗的创面愈合速度及创面血流量和血管密度都大于单独基因治疗或单独细胞治疗，提示联合HIF-1α基因治疗和ASCs细胞治疗优于单独治疗。

接着，本研究进一步探讨了联合HIF-1α基因治疗和ASCs细胞治疗改善糖尿病小鼠创伤修复的作用机制。研究报道，血管生成在创面愈合的增殖阶段具有重要作用[16]。HIF-1α是血管生成过程中的主要调节因子。缺氧激活的HIF-1α可诱导促血管生成生长因子如VEGF的表达[17]。ASCs能通过自分泌或旁分泌的途径来上调一些促进脉管生成的细胞因子的表达如VEGF、血管生成素、bFGF、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子等,其中VEGF是一种主要血管生成因子[20]。那么，联合HIF-1α基因治疗和ASCs细胞治疗改善糖尿病小鼠创伤修复的作用机制是否与其调控VEGF表达有关呢？本研究结果发现，HIF-1α基因联合ASCs治疗组的VEGF mRNA和蛋白表达水平显著高于单独治疗组和对照组，且HIF-1α基因单独组和ASCs单独治疗组VEGF mRNA及蛋白表达显著高于对照组，提示VEGF表达上调可能参与HIF-1α基因及ASCs细胞联合治疗对糖尿病小鼠皮肤创伤修复的促进作用。

综上所述，本研究发现定向激活HIF-1基因协调脂肪干细胞可促进糖尿病小鼠创伤修复。利用与创伤修复有关的分子生物学及干细胞学的研究基础，通过人工干预，局部导入促血管生成基因，并增加外周血促血管生成干细胞数量，充分发挥基因以及细胞治疗在创伤修复中的协同促进作用，以达到加速创伤修复的目的，以期为创伤修复的基因治疗和干细胞联合治疗在临床上的应用提供理论依据。

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