肾透明细胞癌Caki-1细胞系差异表达基因的生物信息学分析

朱合欢 赵虎 林智文 王洁 路君 谭建明

肾癌作为一种常见的实体肿瘤，约占成人恶性肿瘤的2﹪～ 3﹪，在泌尿系统中发病率仅次于膀胱癌。据CA-Cancer J Clin报道，美国仅在2015年就有大约60 000新发肾癌病例，且有14 000人左右死于该病[1]。肾透明细胞癌是肾癌中最常见的病理类型，约占肾癌各种类型的70﹪，因为其缺乏有效的早期诊断方法及特定的生物标志物，30﹪的患者在初次诊断时已有远处转移[2]。由于肾透明细胞癌对放化疗均不敏感，其治疗手段目前仍以外科手术为主。然而肾透明细胞癌具有转移性的特点，部分患者即使经过手术治疗，仍旧会出现转移现象，且转移后的患者预后明显较差[3]。随着分子医学及相关技术（如基因芯片技术）的快速发展，大量肿瘤生物标志物相继被发现并逐步应用于临床[4-6]。然而，当前尚未有肾透明细胞癌的诊断标志物在临床上投入使用。因此，探讨肾透明细胞癌发生发展机制，并找到在该过程中起关键作用的基因及相关信号通路，对肾透明细胞癌的靶向治疗具有重要指导作用。

本研究利用生物信息学方法对基因芯片GSE78179中的2种肾脏细胞系（转移性肾透明细胞癌Caki-1细胞系和胚胎起源的正常肾上皮细胞（ASE-5063细胞系）进行分析，筛选出差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），同 时 对DEGs进行聚类综合分析，同时构建蛋白互作网络进而找到核心基因及相关重要信号通路，为肾透明细胞癌进一步研究其诊断及治疗提供了理论基础。

材料与方法

一、材料

（一）数据材料

利用NCBI中GEO芯片数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）对目标芯片进行检索，检索词为“clear cell renal cell carcinoma，Homo”。经筛选后，采用由Khan等[7]提交的芯片数据（GSE78179），该芯片以Agilent-026652 Whole Human Genome Microarray 4x44K v2（Probe Name version）为平台，共收集了6例细胞样本，其中3例为肾透明细胞癌Caki-1细胞系样本，3例为正常肾组织ASE-5063细胞系样本。

（二）分析软件及数据库

GEO2R基因在线分析工具（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/），Metascape 基 因 聚 类 在线 分 析 工 具（http://metascape.org/gp/index.html），STRING蛋白互作网络在线分析工具（http://stringdb.org/），Cytoscape绘图软件（http://www.cytoscape.org/）及其插件“MCODE”；Funrich基因富集分析软件（http://www.funrich.org/）。

二、方法

采用GEO数据库的GEO2R在线分析工具对两种细胞系细胞进行分析，筛选出差异表达的基因。筛选标准为：|logFC|≥5，adj.P≤0.01。将筛选出的差异表达导入Metascape中进行GO （Gene Ontology）功能富集及京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）等通路的综合分析，然后将DEGs导入STRING中进行基因相互作用的可视化。接着将STRING的结果导入Cytoscape中，并利用MCODE筛选出核心基因互作网络，最后对核心互作网络中的基因进行GO与KEGG通路分析。

结 果

（一）DEGs筛选结果

按照设定的筛选条件，与ASE-5063细胞系相比进行分析，在Caki-1细胞系中共筛选出562个DEGs，其中345个上调，217个下调。筛选结果按照|logFC|值排序，上调与下调排名前5名的基因见表1。

表1 上调与下调排名前5名的差异表达基因

（二）DEGs综合分析

在Metascape中对DEGs进行功能及通路富集分析，按照P值大小排序，前20名富集结果见图1a。P值最小的2个GO富集结果表明这些差异基因与脉管系统的发育（vasculature development）以及泌尿生殖系统发育（urogential system development）密切相关。前20名富集功能相互关联的网络图见图1b。

（三）DEGs相互作用可视化及核心网络筛选结果

图1 差异表达基因Metascape分析结果

将DEGs在STRING中可视化分析，除去孤立无互作的基因节点（node），将分析结果导入Cytoscape，筛选出302个具有相互作用关系节点，构成了一个包涵859个互作关系对（edge）的复杂网络（图2a）。利用Cytoscape软件中的MCODE插件，对图2a中的网络中进行K核解析（k-core decomposition），筛选出网络中的稳定结构。最终筛选出了2个得分最高的子网络，分别为由13个关键基因（Key Genes）及78个互作关系对组成的图2b和由23个关键基因及52个互作关系对组成的图2c。

（四）子网络GO功能分析及KEGG通路富集情况

图2 差异、核心基因互作网络图

通过将子网络中的36个关键基因导入FunRich软件进行GO功能分析，发现关键基因在分子功能（molecular function）上主要富集细胞黏附分子活性（cell adhesion molecule activity）、辅因子结合（cofactor binding）、趋化因子活性（chemokine activity）等相关功能上（图3a），而这些功能在生物学进程（biological process）上主要与细胞通讯（cell communication）和信号转导（signal transduction）等密切相关（图3b）。在STRING中的KEGG通路分析表明这些关键基因与趋化因子信号通路（chemokine signaling pathway）、TNF 信号通路（TNF signaling pathway）以及 NF-κB 信号通路（NF-kappa B signaling pathway）等有着紧密的联系（表 2），为使结果更加清晰可读，其中部分通路及与之相关的基因的关系对在Cytoscape中进行可视化（图4）。

讨 论

肿瘤的整个发生发展进程往往有着多个基因参与，现阶段随着基因组学、比较基因组学、蛋白质组学等方面的快速发展，各种类型的肿瘤逐渐在全基因组水平上被系统的深入研究[8]。在此研究中，通过分析肾透明细胞癌Caki-1细胞系和正常的肾细胞ASE-5063细胞系，发现在Caki-1细胞系中高表达的基因345个，低表达基因217个。通过Metascape中的GO分析发现这个DEGs与脉管系统发育及泌尿生殖系统发育密切相关。随后使用K核解析筛选出这些DEGs中的关键基因如CXCL2、IL8和FGF1等，这些关键基因GO功能分析和KEGG通路富集主要集中在趋化因子活性、TNF信号通路和NF-κB信号通路等。众所周知，肿瘤细胞较正常细胞而言具有生长旺盛的特点，因而Caki-1细胞系中的差异基因富集结果中有脉管系统发育以及参与细胞生长的信号转导因子的各种信号通路，证实了筛选基因方法的合理性。富集通路中的趋化因子等信号通路提示Caki-1细胞具有一定的侵袭迁移能力，这也与目前诸多关于该细胞系的研究报道相符[9-11]。

图3 核心基因GO功能富集分析

表2 核心基因KEGG通路富集分析

本研究中筛选出的与肾透明细胞癌Caki-1细胞系相关的核心基因，如IL-8（白细胞介素8）能够影响治疗肾透明细胞癌药物舒尼替尼的抗血管生成能力，是舒尼替尼发生耐药的重要促成因素[12]。另外，KEGG分析结果表明IL-8参与了NOD样受体信号通路、趋化因子信号通路以及NF-κB信号通路，已有大量相关文献报道了这些通路与肾透明细胞癌有着密不可分的联系[13-15]。CXCL2（CXC趋化因子配体2）虽然尚未有研究报道其直接参与肾透明细胞癌的病理过程，但多个研究报道其在其他多种肿瘤疾病中发挥着重要作用。如在前列腺癌患者中CXCL2能够显著促进患者的骨溶解，并能促进前列腺癌的转移[16]；同样，在乳腺癌患者中CXCL2也能促进癌症的远处转移[17]。和IL-8类似，KEGG分析结果表明CXCL2同样参与了大量与肾透明细胞癌病程相关的信号通路如TNF信号通路[18]、NOD样受体信号通路、趋化因子信号通路以及NF-κB信号通路。其他核心基因如ITGB4（又名CD104），根据图4结果表明其参与了PI3K-Akt信号通路、局部粘附和肌动蛋白骨架的调节。据Nature报道，癌症基因组图谱研究网络（the Cancer Genome Atlas Research Network）的研究人员利用多个平台对400余例肾透明细胞癌肿瘤进行了综合分析，鉴定出19个重要的突变基因，而与这些突变基因最为相关的信号通路则是PI3K-Akt信号通路，该通路涉及特定的DNA甲基化发生过程，从而在该肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用[19]。其他研究则表明局部粘附和肌动蛋白骨架的调节与细胞的迁移侵袭能力直接相关[20-21]。因此，与这三条信号通路密切相关的ITGB4基因有可能是肾透明细胞癌潜在的治疗靶点，值得后续进行更加深入的研究。

此研究通过生物信息学方法在肾透明细胞癌Caki-1细胞系中筛选出了数个核心基因，包括IL-8这种在肾透明细胞癌中被广泛报道的基因，以及CXCL2和ITGB4这种广泛参与多种肿瘤的病理进程但尚未在肾透明细胞癌中报道的基因。通过对这些基因进行功能分析及通路富集分析，有助于对肾透明细胞癌的发病机制及病程进展的进一步研究。同时，筛选出的这些核心基因可通过后续进一步的实验验证，可能会找到肾透明细胞癌的特异性临床诊断标志物并为其靶向治疗提供有力支持，这为肾透明细胞癌的早期诊断以及后续靶向治疗的研究提供了研究基础。

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