水稻抗稻瘟病基因研究进展

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(1.杨凌职业技术学院， 陕西 杨凌 712100； 2.贵州农业职业学院， 贵阳 551400)

水稻是重要的粮食作物之一，全世界三分之一以上人口以稻米为主食。然而，近年来由子囊真菌(Magnaportheoryzae)引起的稻瘟病常年发生，严重影响稻米的品质和产量，给粮食生产造成了重大的经济损失[1]。在我国，随着城市化进程的加速，耕地面积的减少，病虫害防治难度的增加，对现阶段水稻育种工作提出了更高的要求。

稻瘟病属水稻全生育期病害，不同时期发病程度不同。因此，在生产上按照稻瘟病发病时期和部位，一般将稻瘟病分为苗瘟、穗瘟、叶枕瘟等类型，其中苗瘟和穗瘟是影响水稻产量的主要类型[2]。稻瘟病菌变异速度快，种类多且具有很强的环境适应能力。稻瘟病的发生一般受环境温度和湿度的影响，在适宜的温度条件下，阴雨连绵的天气稻瘟病菌最容易滋生并爆发，严重时甚至导致绝收[3]。目前生产上主要通过培育抗稻瘟病新品种和化学防治来抑制病菌繁殖和危害，但以化学防治途径为主要手段。实践表明，使用化学方法防治稻瘟病不仅增加生产成本，还会对生态环境造成污染，因此深入挖掘新的抗稻瘟病基因，并结合分子标记辅助选择育种技术，筛选抗病种质材料并以此培育抗稻瘟病新品种可能是水稻抑制稻瘟病病原菌繁殖和危害的有效手段[4]。随着功能基因组学和生物信息学的发展，水稻和稻瘟病病菌的基因测序和组装工作已基本完成，同时结合水稻与稻瘟病菌互作的“基因对基因”假说，研究抗性基因的定位、克隆、互作及功能解析，不仅能为揭示水稻抗稻瘟病菌的分子机制提供一定的分子基础，同时也能为稻瘟病防治提供新的思路。

1 水稻稻瘟病菌侵染过程

稻瘟病菌的侵染过程最先是从研究稻瘟病菌侵染小麦根部致病机理时发现的，后来Sesma等在此基础上研究发现稻瘟病菌可以由地下部组织侵染水稻根部，并通过维管束侵染整个植株，同时指出稻瘟病对寄主侵染具有组织特异性[5]。稻瘟病菌主要从叶茎表皮和根部侵染水稻，进而形成病斑，其侵染过程可分为以下几个阶段： 1) 孢子附着到寄主表皮，即：具有3个细胞的稻瘟病菌分生孢子飘落到水稻植株叶茎或根部，然后通过顶端分泌的黏合物使孢子紧紧附在水稻叶片表面； 2) 芽管发育，即：分生孢子顶端萌发芽管粘附在宿主表面外基质上； 3) 形成附着胞，即：芽管进一步分化成圆顶状的附着胞，附着胞内含有孢子和芽管自我分解的营养物质，该过程受细胞周期调控； 4) 产生侵入钉，即：在附着胞细胞壁和细胞膜之间有一层黑色素，黑色素对附着胞的侵染十分重要，如附着胞不能形成黑色素时，就不能产生足够大的膨压，从而失去致病力。 5) 在寄主植物中生长，即：初级侵入菌丝在寄主细胞中吸收营养后产生次级菌丝，次级菌丝通过寄主细胞胞间连丝扩散到邻近的细胞，72 h后便可产生明显的坏死症状，即病斑[6-7]。

2 影响水稻稻瘟病发病因素

研究表明，影响水稻稻瘟病发病的因素主要是环境和栽培管理措施[4]。另有研究表明，稻瘟病菌丝适宜繁殖及侵染的最佳温度为26～28 ℃，湿度为80%～90%，因此水稻生育期内若遇阴雨天气，且温度合适，则易引发稻瘟病。除此以外，光照强度，植株长势等因素也会影响稻瘟病的发生[8]。综上，依据当地气候条件和稻瘟病发病规律，选择抗(耐)稻瘟病水稻栽培品种和优化的栽培管理措施，严格执行品种选择标准，则对当地水稻产业抵御或回避稻瘟病具有重要的生产意义。

表1 已克隆的水稻抗稻瘟病相关基因

基因位点 染色体基因长度 蛋白质类型无毒菌株(小种)Pish11289NBS-LRRKyu77-07APit1989NBS-LRRV86010Pi-3711290NBS-LRRCHL1405等Pi6413864NBS-LRRYangmaoguPib21251NBS-LRRBN209bsr-d13C2H2-type transcription factorDigupi214266Proline-Containing protein-Pi634-NBS-LRR-Pi2/Pi961032NBS-LRRPO6-6Piz-t61033NBS-LRR-Pid26441Receptor kinaseZB15Pid3/pi256923NBS-LRRZhong-10-8-14Pi3681056NBS-LRRCHL39Pi5/Pi391025NBS-LRRPO6-6pi5691566NBS-LRRPO6-6Pia/Pi-co3911966NBS-LRRB90002Pik111143、1056NBS-LRRPO6-6Pi1111143、1021NBS-LRRIK81-3,PO6-6等Pikh111143、1021NBS-LRRH05-56-1等Pikm111143、1021NBS-LRRIna86-137等Pikp111143、1021NBS-LRR-pb1111296NBS-LRR-Pita12928NBS-LRRIK81-3,K81-25

3 水稻抗稻瘟病基因的定位与克隆

20世纪60年代以来，国内外研究人员对世界不同地区的种质资源进行了抗性鉴定，一大批优质抗源被筛选出来[9-12]： 1) 地方品种主要有黑壳子粳、湘资3150、Digu、红脚占等； 2) 籼稻品种主要有窄叶青8号、Kasalath、Chubu 32、三黄占2号等； 3) 野生稻品种主要有小粒野生稻、澳洲野生稻等。其中，来自广西的籼稻红脚占对B群小种具有抗性，黑壳子粳对江苏省大部分优势小种具有抗性，水稻品种Tetep具有广谱的抗病性[13-14]。此后，Liang等对 74 份云南地方水稻种质资源的稻瘟病抗性进行了鉴定，结果表明，2个云南地方品种毫弄早、毫玉浪比持久抗病品种 Tetep 和Moroberekan 对稻瘟病的抗性广谱性更大、稳定性更强[15]。

3.1 水稻稻瘟病抗性基因的定位

随着分子生物学的发展，利用分子标记构建遗传图谱，并结合全基因组扫描技术对抗病基因进行定位，并以此开发分子标记是推动水稻抗稻瘟病机制研究及快速实现抗病基因定向转育新品种的重要理论支撑。截至目前，至少已有69个抗病位点超过83个主效基因被鉴定[10-14,16-20]，且大部分抗病基因分布在水稻的6、11号和12号3条染色体上，其中11号染色体分布最多，约占总数的2%，特别是其长臂末端区域形成了一个抗病基因簇；6号和12号染色体也分别存在一个抗病基因簇，这2条染色体定位到的基因分别占总数的14%与15%。

3.2 水稻稻瘟病抗性基因的克隆

截止目前，共有26个抗稻瘟病基因，包括Pb1、Pia、Pib、Pid2、Pid3、Pik、Pik-h、Pi54、Pik-m、Pik-p、Pish、Pit、Pita、Piz-t、Pi1、Pi2、Pi5、Pi9、pi21、Pi25、Pi36、Pi37、Pi50、Pi64、Pi56、Pi63被克隆，Piz和Pik位点上存在多个复等位基因，其中11号染色体上被克隆的基因最多，共8个；此外，6号染色体上有7个，其中大部分被证明是等位基因(表2)[10-14,16-18]。6号染色体已克隆的稻瘟病抗病基因有Pi9、Pi2、Piz-t、Pigm、Pid2、Pid3和Pi25，其中Pid2、Pi-2、Piz-t、Pi9、Pigm是5个抗病等位基因，来自不同的抗病品种。Pi-2和Pi9均属于NBS-LRR类基因，其中Pi-2含有2个内含子，互补试验证明Pi-2基因即为：Nbs 4，其编码产物约含有1 032个氨基酸残基，与Piz-t基因编码的蛋白质序列仅有8个氨基酸残基的差异；Pi-2、Pi9基因编码的蛋白质序列同样也是由1 032个氨基酸残基组成，其中Nbs2-Pi9为Pi9基因编码蛋白质序列羧基端由17个不完整的含有富亮氨酸重复域(LRRs)组成[9]。11号染色体上已被克隆的稻瘟病抗病基因有Pia、Pi-co39、Pb1、Pi-k、Pikh、Pikm、Pikp等，其中Pia和Pi-co39是等位基因，另外，采用经典遗传学方法，经功能基因组学验证Pia由2个相邻的NBS-LRR基因组成。其次，研究表明，Pi-k、Pikh、Pikm、Pikp等4个基因是等位基因，对稻瘟病具有较强的抗病性，随后利用基因组学技术对Pi-k研究分析发现，该位点的抗病性主要由2个基因共同协同表达决定，二者缺一不可。通过进化树分析发现Pi-k与其他NBS-LRR类基因亲缘关系较远。此外，pi21是目前唯一在水稻中被克隆的隐性稻瘟病抗病基因，来自Owarihatamochi，对稻瘟病具有中等抗性，属于功能丧失性突变。此外，Pi21编码的蛋白质由266个氨基酸构成，且结构复杂，可能含有重金属结合和蛋白质互作2个结构域，富含脯氨酸。与感病品种相比，抗病亲本中pi21基因中碱基的缺失导致其具备抗病能力[21]。这一基因的发现及克隆，更加有助于水稻抗稻瘟病机理的研究。

4 抗稻瘟病分子育种

水稻育种工作在经历2次绿色革命(矮化育种和杂交育种)后，其育种目标发生了较大的改变，现阶段新品种选育工作主要围绕提高品质、产量及抗病性等。然而，水稻的抗病育种大多仍采用常规育种方法，即杂交、回交、轮回选择等，同时结合田间农艺性状选择和抗性鉴定，将抗病品种所携带抗稻瘟病基因导入目标株系，进而育成新的抗病品种，如广东省的优质稻主栽品种粤晶丝苗2号、黄华占、齐粒丝苗、特籼占25和沈阳农业大学选育的沈农系列水稻等，但是，传统水稻抗稻瘟病育种主要凭经验，往往在选育过程中会出现选择效率较低，抗病性丢失的现象[9]。因此，随着生物技术的发展，育种家们将分子育种技术(转基因技术和分子标记辅助选择技术)与传统育种技术相结合很大程度上提高了水稻抗稻瘟病新品种选育的效率和水平。

4.1 转基因抗病新材料的选育

近年来，水稻遗传转化技术得到了迅猛发展，其主要有：农杆菌介导技术、基因打靶技术以及通过原生质体导入外援DNA技术。随着上述分子生物学研究手段的完善，水稻转基因育种技术慢慢兴起，并取得了显著的成效。

转基因育种，即在不改变受体作物其他遗传背景的情况下，使控制单一或多个性状的基因被导入受体作物，从而有效的克服受体作物的遗传缺陷，利用常规育种技术进行杂交选育，最终获得性状稳定的转基因株系。在水稻抗稻瘟病育种方面，育种家往往利用转基因技术将一些可以诱导或刺激参与对病原菌生存不利的化合物合成基因或直接抑制病原菌生长的基因转入受体水稻，并进行杂交选育，从而筛选出新的抗稻瘟病新材料，其关键性基因主要有，如：几丁质酶基因，植物抗毒素基因，几丁质酶-葡聚糖酶基因，天花粉素基因，山葵植物抗毒素基因，核糖体失活蛋白基因，葡萄糖氧化酶基因，溶菌酶基因和水稻Pi-ta、Pi-9、Pi-2基因等[22-23]。研究表明，上述基因转入水稻植株后，对增强受体材料的稻瘟病抗性具有明显的作用。

4.2 分子标记辅助选择育种(MAS)

分子标记辅助选择育种主要利用DNA分子标记技术筛选目的基因，并在育种后代进行准确选择，主要技术有限制性片段长度多态性(RFLPs)、随机扩增多态性DNA(RAPDs)、简单重复序列(SSR)、酶切扩增多态性序列(CAPS)、扩增片段长度多态性(AFLP)、核苷酸多态性(SNP)等。水稻抗稻瘟病育种主要采用回交和轮回选择技术，既费时费力，又对环境条件有较高的要求，因此结合分子标记辅助选择育种技术，可大幅度减少抗病育种周期，且安全可靠。目前，Ashkani等开发的SSR分子标记(RM 168，RM 8225，RM 1233，RM 6836，RM 5961和RM 413)已广泛应用到水稻抗病新品种选育的分子标记选择实践中[24-25]。同时，分子标记辅助选择育种技术也已被成功用于追踪Pi-b、Pi-k、Pi-i、Pi-z、Pi-ta、Pi9等一些抗瘟病基因在后代群体内的渗入和在个体内的累加状况，并筛选出多个具有广谱抗性的水稻抗稻瘟病新品系，如马文清等[26]利用分子标记辅助选择育种技术将抗稻瘟病基因Pi9和抗褐飞虱基因Bph18(t)导入到恢复系测679中，且获得了稳定的转基因抗病株系；罗彦长等利用分子标记辅助选择育种技术，在水稻品种9311内成功聚类了稻瘟病抗性基因Pi9、枯萎病抗性基因Xa21、Xa27以及耐渍基因Sub1A，且培育出了新的综合抗性较好的水稻新品种49311[27]。总体而言，随着分子生物学的发展和越来越多抗病基因的鉴定与克隆，分子标记辅助选择育种将在培育优质、稻瘟病抗性持久的水稻品种中发挥着重要作用。

4.3 基因编辑技术在水稻抗稻瘟病中的运用

转基因技术已广泛应用于水稻育种工作，但该技术自身也具有一定的缺陷。一方面，外源基因随着“基因漂流”而非人为的转入其他机体内，在植物基因组内随机整合，容易诱发突变，造成基因库的污染。另一方面，转基因农作物作为一种新的人造品种，在一定程度上会破坏原有的食物链结构，引发生态环境的失衡。此外，转基因农作物的遗传具有不稳定性，难以保障粮食生产，进而引发社会在健康和环境安全方面对转基因技术的怀疑，从而在社会上受到一定程度的排斥。针对上述问题，基因编辑技术应运而生。基因编辑技术是利用序列特异性核酸酶促使基因组内部出现DNA双链断裂，进而诱导细胞行使内源修复功能，最终实现对DNA特定序列的精确修饰(替换、插入或缺失)。截止目前，有4类核酸内切酶已被广泛用于切割几乎所有物种的所有核酸序列，分别是：特定序列的核酸内切酶，大范围核酸内切酶，锌指核酸内切酶，转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)，规律成簇间隔短回文重复核酸内切酶(CRISPR Cas 9)。该技术的产生对培育水稻抗稻瘟病新品种带来了新的机遇，如：Wang等[28]利用CRISPR Cas 9技术将水稻ERF转录因子OsERF 922定点突变，最终获得了兼具优良农艺性状的抗稻瘟病转基因株系；Li等[29]利用CRISPR Cas 9技术抑制bsr-d1基因表达，水稻表现出明显的抗稻瘟病特性，经抗病性试验证实，bsr-d1是一个水稻稻瘟病广谱抗性基因。

5 问题与展望

近年来，水稻稻瘟病逐渐成为流行性病害，并严重威胁水稻产量和影响水稻品质，其原因主要是因为稻瘟病小种的高度变异性。随着稻瘟病生理小种的变异，一些抗病品种慢慢的会出现抗病性丢失，其主要可能是由于抗病品种在同一个地区长期种植，与当地稻瘟病生理小种形成一个相对和谐的竞争关系，然而一旦稻瘟病生理小种发生变异，则致使水稻的抗病性减弱，甚至丧失，最终表现为感病。然而，随着病原菌新的生理小种的不断出现，促使水稻抗稻瘟病新品种不断更新，因此，稻瘟病抗性新基因的发掘和利用将对水稻有效抵抗稻瘟病侵染具有重要的生产意义，同时也是一项长期的研究课题。鉴于此，建议利用以下3种方法可降低抗病品种抗性丢失的比率：第一，挖掘或筛选含有多个微效抗稻瘟病基因的水稻品种。这些品种通常在一个地区种植多年仍保持抗性，在株型或产量构成因素方面加以改良，可产生新的在这一区域内推广的抗病品种。水稻地方品种的抗病性主要是在当地病菌与寄主长期的进化演变中产生的，一般具有抗谱宽，抗性持久等特点，如：黑壳子粳、地谷和红脚占等；第二，以地方品种为材料利用转基因技术进行抗病性基因聚合育种，培育超级抗病品种是应对病原菌小种不断变异的重要手段；第三，优化水稻的栽培管理措施，增强水稻群体的生长势，从而提高水稻群体对稻瘟病的抵抗能力。

目前尽管在稻瘟病抗病育种方面取得一定的成绩，但是在稻瘟病抗性研究方面，仍存在一些问题，如： 1) 稻瘟病的广谱或持久性抗源材料及抗性基因短缺； 2) 稻瘟病抗病基因经常与一些农艺性状差的基因连锁，从而增加了抗病基因的分离和稳定新抗病材料的难度； 3) 由于序列信息不全造成部分抗稻瘟病基因不能被分离和鉴定； 4) 抗稻瘟病基因数目不少，但存在一定程度的“异名同工”现象。因此，水稻稻瘟病防治及抗稻瘟病基因筛选与抗病育种工作任重而道远，仍需深入开展。因此，利用分子生物技术与常规育种相结合将是开展水稻抗稻瘟病新品种选育的趋势。

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