黑大豆种子球蛋白提取及SDS-PAGE分析
2018-06-08，，
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(齐齐哈尔大学生命科学与农林学院， 黑龙江 齐齐哈尔 161006)
大豆为豆科植物，因其种皮颜色不同分为黄大豆和黑大豆，黑大豆可药食两用，在我国由南到北28个省市有广泛的分布[1]。黑大豆种子中蛋白质含量丰富，占比可达36%～40%，并居豆类之首[2-3]。有关黑大豆种子球蛋白的提取研究目前所见报道较少，本实验对黑大豆种子球蛋白的提取及电泳体系进行了研究，旨在建立黑大豆种子球蛋白提取的简单易行的优化体系。
1 材料和方法
1.1 实验材料
在市场上购买黑大豆种子并研磨成粉末用于实验。
表2 实验安排
温度(℃)405060试管号147258369固液比1∶71∶101∶131∶71∶101∶131∶71∶101∶13时间(h)123231312提取液浓度(%)ABCBCACAB
1.2 实验方法
1.2.1 黑大豆种子球蛋白的提取
采用三水平四因素的正交试验，如表1所示。提取液分为3组，每组分为3个浓度梯度，用A、B、C表示。第一组为A：0.5%NaCl、B:1.0%NaCl、C：1.5%NaCl；第二组为A：2.0%NaCl、B：2.5%NaCl、C：3.0%NaCl；第三组为A：3.5%NaCl、B：4.0%NaCl、C：4.5%NaCl。
表1 正交实验设计
因素水平固液比(g/mL)温度(℃)时间(h)提取液浓度(%)11∶7401A21∶10502B31∶13603C
按表2进行实验，水浴结束后将试管内的溶液移至离心管中，6 000 r/min离心15 min弃去沉淀，测定上清液中黑大豆球蛋白含量。
1.2.2 电泳实验
采用SDS-PAGE法进行电泳实验，浓缩胶浓度为4%，分离胶浓度为12%。
2 结果与分析
2.1 黑大豆球蛋白的提取及分析
图1为第一组提取液(NaCl浓度分别为A：0.5%、B:1.0%、C：1.5%)提取黑大豆种子球蛋白的实验结果，通过极差计算可以看出，4种因素对黑大豆球蛋白提取的影响有所不同，其中固液比对提取影响较大，极差为0.354，影响较小的是提取液的浓度，极差为0.055。
图1 第一组提取液提取黑大豆球蛋白实验结果
图2为第二组提取液(A：2.0%NaCl、B：2.5%NaCl、C：3.0%NaCl)提取黑大豆种子球蛋白的实验结果，4种因素固液比、温度、时间和提取液浓度对提取体系影响的极差相应为0.169、0.151、0.089和0.045，与第1个提取体系一致的是固液比对提取影响较大，影响最小的因素是提取液浓度。
图2 第二组提取液提取黑大豆球蛋白实验结果
图3为第三组提取体系(A：3.5%NaCl、B：4.0%NaCl、C：4.5%NaCl)对黑大豆种子球蛋白提取的实验结果，通过极差分析可见，对提取影响较大的因素是固液比，极差是0.295，影响较小的因素是温度极差为0.023。
图3 第三组提取液提取黑大豆球蛋白实验结果
2.2 SDS-PAGE分析
图4～图9分别显示了3个提取体系所提取的黑大豆种子球蛋白SDS-PAGE图谱，从图谱可以看出，不同的提取体系相同的上样量及同一提取体系不同的上样量，所得到的电泳图谱的电泳条带数量和清晰度均出现了不同。对于同一个提取体系均表现出10μL上样量的电泳条代数多于7μL上样量的电泳条带数，并有较好的清晰度。而在相同上样量的情况下，第三组提取液所提取的黑大豆球蛋白的电泳图谱条带数量较多且较清晰。
图4 第一组10 μL上样混合液1～9号管电泳图谱
图5 第一组7 μL上样混合液1～9号管电泳图谱
图6 第二组10 μL上样混合液1～9号管电泳图谱
图7 第二组7 μL上样混合液1～9号管电泳图谱
图8 第三组10 μL上样混合液1～9号管电泳图谱
图9 第三组7 μL上样混合液1-9号管电泳图谱
3 结 论
不同提取条件对黑大豆种子球蛋白提取有不同影响，本研究所设置的不同提取体系中对提取影响最大的因素是一致的，均为固液比，但影响最小的因素有所不同，第一组和第二组为提取液浓度，第三组为温度。在本实验的处理体系中，对于黑大豆球蛋白SDS-PAGE最优化的体系是：提取液浓度为4.0%NaCl、固液比为1∶7、提取温度为50 ℃、提取时间为2 h、上样量为10μL的电泳体系。
参考文献：
[1]袁利鹏,杨君,赖来展,等.黑大豆营养功能及开发豆皮色素的探讨[J].农产品加工·学刊,2009,160(1):49-52.
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[3]江甜,何毅,祝振洲,等.黑豆蛋白的分级提取及黑豆花色苷的成分鉴定[J].食品科学,2017:38(4):217-221.
[4]张艳馥,任艳波,沙伟,等.大豆种子醇溶蛋白的提取及 SDS-PAGE分析[J].种子,2015,34(11):41-43.
