老年小鼠血脑屏障在术后认知功能障碍中的作用

朱红花 方 浩

(复旦大学附属金山医院麻醉科 上海 201508)

老年患者手术麻醉后经常发生术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction,POCD),表现为注意力、近期记忆、社会行为和语言理解能力的损害[1-3]。POCD可降低生活质量,延长患者的住院时间,影响恢复过程[1-4],是一种65岁以上老年患者经常发生的手术并发症,具体机制尚不明确。

血脑屏障(blood brain barrier)是一个将中枢神经系统与外周血液循环相隔离的多细胞血管结构。BBB通过保护大脑免受毒素和病原体侵害,保持脑内环境稳定,维持神经元的正常功能。生理状态下,BBB的内皮细胞形成连续的细胞间网络紧密连接。咬合蛋白claudin-5和闭合蛋白occludin是紧密连接蛋白的关键部件[5],并有基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)裂解位点,可以通过从细胞外基质分离内皮细胞,破坏血脑屏障。有研究发现,血脑屏障功能降低可导致年龄相关性认知功能障碍[6]。同时也有研究发现,手术可影响血脑屏障的渗透和功能[7]。另一方面,MMP的活化能降低缺血性卒中的claudin-5和occludin表达,增加血脑屏障通透性。因此我们推测,POCD可能与血脑屏障的破坏有关,而MMP和紧密连接蛋白的变化可能是术后血脑屏障破坏的原因。

材 料 和 方 法

实验动物健康雄性C57BL/6小鼠(18月龄)由上海斯莱克实验动物有限公司提供,饲养于具有层流系统的无菌环境,维持室温23 ℃,昼夜周期12 h轮转,给予充足的食物和水。将小鼠随机分为3组:对照组(C组,n=10),动物不予任何干预;手术组(S组,n=10),动物在全身麻醉下接受阑尾切除术,腹腔注射0.5%戊巴比妥0.2 mL。腹正中切口1～2 cm暴露阑尾,切除阑尾后无菌缝合缝扎紧盲端,并缝合伤口;吸入组(I组,n=10),将小鼠放在一个连接异氟醚挥发罐的透明箱子内(30 cm×15 cm×15 cm),在箱内吹入1.2%异氟烷和100%氧气1 L/min,维持2 h。3组小鼠分别在干预后第3天和第30天进行水迷宫实验(Morris Water Maze)。于第1、3、7、14天采用伊文思蓝(Evans-blue,EB)透过率检测各组海马区血脑屏障通透性的改变,并通过Western blot检测occludin和claudin-5蛋白,观察手术后紧密连接蛋白的变化,并检测MMP-2和MMP-9的改变。

水迷宫实验水迷宫实验是一种检测啮齿类动物依赖于海马的空间学习能力的方法。圆形水槽(直径80 cm)内充满(22±1)℃不透明水,四周贴有如正方形、菱形等不同图形,隐藏平台低于水面1 cm,实验鼠要根据这些图形来找到水面下的隐藏平台,记录时间作为潜伏期。第1～5天每天从4个入水点中随机选1个点将小鼠面向池壁放入水中,60 s内未找到平台的小鼠由测试者引导其上台停留15 s,第6天时移走平台进行测试。通过安装在天花板上的摄像机记录,用水迷宫软件对数字图像进行分析,记录平台穿越次数和潜伏期时间。

血脑屏障通透性测定方法采用EB外渗法测定血脑屏障通透性。2% EB染料(4 mL/kg)经小鼠尾静脉注射。3 h后待染料充分经过血循环后,每组取6只小鼠,用0.2 mL戊巴比妥钠腹腔注射,并用50 mL生理盐水通过左心室进行灌注后取海马。每个海马浸于1 mL甲酰胺(美国Sigma-Aldrich公司)。样品于37 ℃孵育2 h后,甲酰胺混悬液经420 000×g离心20 min,测量每份海马在632 nm的吸光度(D)。EB染料含量根据甲酰胺内EB的标准曲线计算(0～4μg/mL)。

Westernblot检测分离小鼠海马组织,加入NP-40裂解液,加PMSF并研磨匀浆,然后15 000×g,离心10 min。以2倍上样缓冲液50μL裂解,然后收取细胞,置于沸水中彻底变性5 min。取10μL样品,进行10% SDS-PAGE电泳。将膜浸入5%脱脂奶粉封闭液中缓慢振荡90 min,用PBST液洗涤3次,每次5 min,加入1∶5 000稀释鼠抗β-微管蛋白和1∶1 000稀释抗claudin-5/抗occludin,4 ℃放置过夜,用PBST液洗涤3次,每次10 min;加二抗1∶2 000稀释羊抗鼠和羊抗兔IgG-HRP,室温放置1 h,用PBST洗涤3次,每次10 min。相同体积两种液体混合后滴加在膜上,进行发光拍照。

结 果

阑尾切除术和吸入麻醉对认知功能的影响阑尾切除术和1.2%异氟醚暴露后,小鼠在术后第3天(D3)和第30天(D30)进行水迷宫测试以评估空间学习记忆,D3和D30分别代表近期记忆和远期记忆。相比对照组和吸入组,手术组小鼠术后3天的潜伏期明显延长(P<0.05,图1A),平台跨越次数显著减少(P<0.05,图1B),3组在术后30天时组间差异无统计学意义。3组小鼠的游泳速度无差异(图1C),表明手术组和其他两组之间潜伏期及平台穿越次数之间的差异和运动缺陷无关(表1)。上述结果表明,手术可引起短暂的认知功能受损,但不引起远期认知功能受损。暴露于1.2%异氟醚2 h并没有引起认知功能障碍。

(1)P< 0.05.

图1水迷宫试验测得3组老年小鼠的潜伏期、平台穿越次数和游泳速度
Fig1Resultsoflatency,timescrossingplatformandswimmingspeedinMorrisWaterMazetestofthreegroupsofagedmice

Control groupSurgery groupInhalation groupLatency (s) D325.18±4.6035.91±4.53(1)(2)28.16±5.68 D3020.35±3.8423.01±11.8218.49±14.33Times crossing platform D34.50±0.933.00±0.76(3)(4)4.22±120.00 D304.17±0.753.60±0.893.33±1.37Swimming speed (m/h) D3143.50±30.60153.02±31.90153.35±33.16 D30140.91±22.46134.71±14.54133.79±25.08

vs.Control group,(1)P<0.001,(3)P=0.003;vs.Inhalation group,(2)P=0.008,(4)P=0.026.

阑尾切除术对血脑屏障的破坏EB是一种无毒的染料,能结合血清白蛋白,在正常生理条件下几乎不穿过血脑屏障。在血脑屏障通透性增加的情况下EB-白蛋白复合物才有可能进入脑组织。由于这

一特性,EB被广泛用于检测血脑屏障的完整性。与对照组及吸入组相比,手术组在实验后第1、3天EB定量显著提高,这一变化在第7天依然存在(P<0.05),在第14天时恢复正常基线,提示阑尾切除手术可导致血脑屏障通透性增加,而异氟醚吸入对血脑屏障通透性没有影响(图2,表2)。

(1)P< 0.05.

图23组老年小鼠的海马血脑屏障通透性
Fig2Permeabilityofbloodbrainbarrierofhippocampusinthethreegroupsofagedmice

表23组老年小鼠海马内的EB数定量
Tab2Evansblueinhippocampalinthethreegroupsofagedmice

GroupD1D3D7D14Control 19.69±2.8619.19±4.0418.36±3.6119.86±3.55Surgery 34.12±4.74(1)32.84±5.64(2)28.01±3.87(2)23.88±6.88Inhalation 21.21±4.99(3)20.11±5.21(4)21.18±4.28(5)22.43±4.78

vs.Control group,(1)P<0.001,(2)P=0.001;vs.Surgery group,(3)P=0.001,(4)P=0.002,(5)P=0.016.

维持血脑屏障低通透性的一个重要原因是紧密连接蛋白。occludin和claudin-5是两种重要的紧密连接蛋白,许多中枢神经系统疾病可导致血脑屏障的破坏。我们分析了老年小鼠在经过阑尾切除术后第1、3、7、14天海马内occludin和claudin-5蛋白水平变化。结果发现,与对照组比较,手术组小鼠海马内occludin表达在术后第1天显著降低(P<0.05),术后第3、7天依然低于正常,但呈现逐渐恢复趋势,术后第14天时完全恢复正常;而手术组与对照组比较claudin-5表达差异无统计学意义(图3A、3B)。MMP-2和MMP-9通过破坏神经血管间距和减少紧密连接蛋白而破坏血脑屏障。我们在术后第1、3、7、14天检测了MMP-2和MMP-9蛋白质水平,发现术后第1天MMP-9升高,并和occludin的下降一致,于术后第14天回归基线。而MMP-2的变化由术后第3天开始,在第7天仍然持续,第14天回归正常(图3C、3D)。

(1)vs.group C,P<0.05.C:Control group (n=6).

图3阑尾切除术后老年小鼠海马内occludin、claudin-5、MMP-2和MMP-9的蛋白表达
Fig3Proteinexpressionsofoccludin,claudin-5,MMP-2andMMP-9inhippocampusofagedmiceafterappendectomy

讨 论

POCD是指麻醉和手术后出现的认知功能改变,包括记忆能力下降、注意力不能集中等,更严重的表现还有人格改变和社会行为能力下降[1]。还有一部分患者甚至发展为不可逆的认知障碍[2],严重降低生活质量,增加术后死亡率。

麻醉和外科手术是引起POCD的两个关键环节。既往大量有关POCD 的机制研究多集中在全身麻醉药物,认为挥发性吸入麻醉药(如异氟醚)是引起POCD 的主要原因[3-4]。然而临床研究却发现,即使不应用全麻药,在局部麻醉下手术仍然可能发生POCD[8-9],因此手术因素在POCD发生过程中的作用不容忽视。动物实验也证明不应用吸入麻醉药,而采用芬太尼加氟哌利多麻醉下行脾脏切除术,动物的学习和记忆能力也出现明显下降,而单纯麻醉对于动物的学习和记忆并没有影响[10]。此外,Togo等[11]和Cibelli等[12]的研究也证明,胫骨骨折内固定术可以造成术后短暂的学习和记忆能力下降。在本研究中,手术组在术后第3天时的潜伏期延长,平台穿越次数减少,表明手术组发生了认知障碍,而吸入组并没有发生认知学习障碍。另一方面,在第30天时各组之间的认知功能并无差异,提示手术对认知的影响在短期内明显,而长期持续性的伤害并不确定。此外,单纯的吸入麻醉并不会影响老年小鼠的长期和短期认知功能。

POCD发生机制复杂,目前对血脑屏障的关注日益增加。血脑屏障主要由脑微血管内皮细胞、基底膜、星形胶质细胞和周细胞构成,能防止病原体和毒素等大分子物质扩散进入脑实质,神经系统内环境的相对稳定才得以维持。有实验显示血脑屏障功能降低部分作用于年龄相关的认知功能紊乱[13]、高血压和2型糖尿病[14]。最近的研究发现,吸入麻醉[15]和外科手术[16]对血脑屏障通透性和功能有不利影响,所以术后认知功能的下降可能与血脑屏障的破坏有关。本实验通过检测EB通透性发现,和对照组及吸入组相比,手术组术后第1、3天的EB定量显著提高,这一变化在第7天依然存在,在第14天时恢复正常基线,提示阑尾切除手术可导致血脑屏障功能通透性降低,而单纯吸入麻醉对血脑屏障通透性无影响。

为进一步阐明手术增加血脑屏障通透性的机制,我们观察了紧密连接蛋白的变化。紧密连接蛋白是密封相邻内皮细胞的间隙,从而限制跨越血脑屏障的分子转运。紧密连接蛋白保持了血脑屏障的低通透性。occludin和claudin-5在由血脑屏障破坏所致的多种中枢神经系统疾病中起重要作用。occludin的紧密连接是保持血脑屏障完整性的重要因素之一,它是首个被分离出来组成紧密连接的完整膜蛋白[17],是紧密连接蛋白的主要结构蛋白。血脑屏障通透性明显低于其他血组织屏障的重要原因是occludin在脑组织血管内皮的表达明显高于非神经组织的血管内皮,当转录水平和翻译水平的occludin表达均受到抑制时,紧密连接蛋白崩解造成紧密连接开放,血脑屏障完整性受损。claudin参与维持紧密连接的选择渗透性和细胞极化,是紧密连接复合物的另一主要构成成分[18]。claudin-3和claudin-5在脑微血管循环内皮系统中表达丰富,有研究认为claudin-5是构成血脑屏障的主要跨膜蛋白[19]。这些都说明occludin及claudin-5的表达与血脑屏障的低渗透功能关系密切。我们发现,与对照组比较,手术组小鼠海马occludin的表达在术后第1天显著降低(P<0.05),并于术后第3天和第7天逐渐恢复,于术后第14天恢复正常。说明手术后occludin表达减少,从而导致血脑屏障的完整性受到破坏。而本实验并未发现claudin-5有显著性改变,其原因有待进一步研究。

许多细胞因子[20]、蛋白酶[21]和MMP22]都能通过影响紧密连接蛋白而破坏血脑屏障功能。MMP等通过降低occludin和claudin-5的表达破坏血脑屏障结构。MMP是一组锌、钙依赖性蛋白水解酶家族,在降解细胞外基质过程中起主要作用。在生理条件下,MMP主要以无活性的酶原形式存在,在炎性介质作用下转化为活性成分,其中与血脑屏障关系最为密切的是明胶酶,明胶酶包括MMP-2和MMP-9。MMP-2和MMP-9通过破坏神经血管间距和减少紧密连接蛋白而破坏血脑屏障。基于以上原因,我们在手术后第1、3、7、14天检测了MMP-2和MMP-9,结果发现术后第1天 MMP-9升高,并和occludin的下降一致,于术后第14天回归基线。而MMP-2的变化由术后第3天开始,并在第7天仍然持续,第14天时回归正常。因此我们认为,手术可导致MMP-9激活,从而破坏紧密连接蛋白occludin,引起血脑屏障通透性改变,导致一系列脑内变化,并最终导致POCD。

本研究发现手术能引起POCD,并导致血脑屏障破坏,紧密连接蛋白下降和MMP-2、MMP-9水平升高可能参与了血脑屏障破坏。虽然老年小鼠阑尾切除术后发生血脑屏障破坏,但仍很难确定血脑屏障的破坏是POCD的主要原因。今后有必要进一步明确,是血脑屏障破坏导致的一系列损伤还是损伤导致BBB的破坏,我们将通过干预MMP进一步研究血脑屏障在POCD中的作用。

参 考 文 献

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