钙蛋白酶介导 NF-κB/STAT3通路调控 巨噬细胞极化的分子机制

胡琼依 王 强

(1复旦大学附属中山医院皮肤科 上海 200032; 2上海交通大学医学院附属瑞金医院风湿免疫科 上海 200025)

巨噬细胞具有高度的异质性和可塑性,是器官和系统的重要调节和效应细胞,在炎症反应中充当桥梁作用[1]。近年的研究表明,许多器官的巨噬细胞在胚胎发育期就定植于组织,并进行自我更新[2-3]。在各种微生物和其他环境因素刺激下,巨噬细胞向具有不同功能的亚型极化,通常分为经典激活的M1型巨噬细胞(classically activated macrophage,CAM)和替代激活的M2型巨噬细胞(alternatively activated macrophage,AAM)[4]。在Th1细胞分泌的干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的刺激下产生M1型巨噬细胞,分泌促炎因子如IL-12、IL-23和TNF-α,合成诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)等;M2型巨噬细胞在IL-4刺激下分泌抗炎因子,如IL-10、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)及合成精氨酸酶-1 (arginase-1,Arg-1)等[5-6]。M1与M2型巨噬细胞之间的平衡对于维持免疫系统稳态具有重要作用,巨噬细胞极化中多种转录因子相互作用,核因子-κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信号通路促进巨噬细胞向M1型极化;而信号转导和转录活化蛋白3 (signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)信号通路促进巨噬细胞向M2型极化[7]等。

钙蛋白酶(calpain)属于钙离子依赖激活的中性半胱氨酸蛋白酶[8],广泛表达于哺乳动物和其他多种生物。钙蛋白酶家族有15个成员,其中广泛表达且研究相对较多的是μ-calpain(calpain1)和 m-calpain(calpain2)。它们由两个亚基组成,为异二聚体,分别由capn1和capn2基因编码的大亚基即催化亚基(相对分子质量80 000)和capn4基因编码的小亚基即调节亚基(相对分子质量28 000)组成。激活calpain1和calpain2分别需要约50和1 000μmol/L的钙离子,其参与多种疾病的发生发展,包括肌肉功能障碍[9]、糖尿病[10]、心衰[11]等。我们团队研究发现抑制calpain活性后,通过下调NF-κB信号通路而不是激活其上游的IKK(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase)活性,减轻了内毒素引发的心肌梗死的炎症和心肌重建[12],从而改善了心肌缺血的现象[13]。

研究发现,对calpain的抑制可以直接减少小鼠心肌梗死模型中心肌组织M2的激活[14],对缺氧状态下TGF-β刺激的巨噬细胞活化变弱[15];另外,激活calpain活性可以通过磷酸化STAT6而使M2激活[16],但既往研究均未对calpain调控巨噬细胞极化的作用和机制做深入探讨;本研究以巨噬细胞RAW264.7为模型,通过细胞转染技术对calpain进行干预,探索calpain通过NF-κB/STAT3通路调控巨噬细胞极化而发挥其诱导炎症或抗炎症的作用。

材 料 和 方 法

细胞和试剂巨噬细胞系RAW264.7由ATCC提供。Lipofectamine 2000 (美国Invitrogen公司),Opti-MEM(美国Invitrogen公司),脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)(美国Sigma公司),IL-4 (美国Peprotech公司),细胞质与细胞核蛋白提取试剂盒、BCA试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司),兔抗小鼠磷酸化p65单克隆抗体、兔抗小鼠磷酸化IKK单克隆抗体、兔抗小鼠p-JNK单克隆抗体、兔抗小鼠 STAT3单克隆抗体(美国CST公司),Trizol试剂盒、ECL显影剂(美国Thermo Fisher Scientific公司),逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒(美国Takara公司),Transwell小室(滤膜直径6.5 mm,美国Corning公司)。

细胞培养和体外诱导、鉴定巨噬细胞系RAW264.7培养采用含10% 胎牛血清、青霉素(100 U/mL)、链霉素(100 mg/L)的 DMEM培养基,在含5%CO2的37 ℃恒温培养箱中培养。体外诱导用0.1μg/mL LPS培养 28 h,诱导出M1型巨噬细胞;采用0.02μg/mL IL-4培养28 h,诱导出 M2 型巨噬细胞[17]。

calpain1/2体外干扰通过Lipofectamine 2000将calpain1-siRNA和calpain2-siRNA分别转染巨噬细胞(RAW264.7) 48 h后,分别诱导形成M1、M2型细胞。

qRT-PCR检测mRNA水平利用Trizol法提取巨噬细胞总RNA,利用逆转录试剂盒合成 cDNA。引物设计与合成序列见表1。利用qRT-PCR试剂盒扩增,采用两步法,第1步预变性:95 ℃ 60 s;第2步PCR反应:95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40个循环;第3步:溶解曲线分析。使用2-ΔΔCt法计算各样本中相对mRNA量。

表1 qRT-PCR反应所用引物序列Tab1 The primers sequence of qRT- PCR

Westernblot检测蛋白质水平提取细胞核总蛋白和细胞质蛋白,Western blot检测巨噬细胞内calpain1、calpain2、p-IKK、p-JNK、p-p65和STAT3的蛋白质水平,显影后的条带用Image J 软件分析灰度值。

Transwell迁移试验巨噬细胞siRNA转染48 h后,体外诱导为M1和M2型巨噬细胞,细胞用胰蛋白酶消化,制成细胞悬液铺于Transwell上室,在Transwell下室加入含10%胎牛血清的DMEM培养基,上室加入细胞悬液,培养24 h后用棉签小心擦去上室内的细胞,用Giemsa染色,在显微镜下观察并拍照,平均取10个视野,计算迁移的细胞数。

结 果

不同浓度LPS和IL-4刺激巨噬细胞后对calpain表达的影响与正常对照组相比,0.01～1.0μg/mL的LPS刺激24 h后,巨噬细胞内calpain1 mRNA水平降低,以0.01和0.1μg/mL较显著(P<0.05);0.02～0.1μg/mL IL-4刺激24 h后,巨噬细胞内calpain1 mRNA水平明显升高(P<0.05)。我们发现0.1和1.0μg/mL的LPS刺激24 h后,巨噬细胞内calpain2 mRNA水平均显著升高(P<0.05);0.02和0.1μg/mL IL-4刺激24 h后,巨噬细胞内calpain2 mRNA水平降低,以0.02μg/mL最为明显(P<0.05,图1)。

M1、M2型巨噬细胞内calpainmRNA水平变化通过0.1μg/mL LPS或0.02μg/mL IL-4体外诱导M1、M2型巨噬细胞,qRT-PCR检测M1相关的因子IL-23、TNF-α、iNOS和M2相关的因子IL-10、TGF-β、Arg-1的mRNA水平,结果表明M1、M2型巨噬细胞标志物存在着明显的不同(图2)。

A:Calpain1 mRNA expression level;B:Calpain2 mRNA expression level.(1)P<0.05.

图1LPS和IL-4刺激巨噬细胞后calpainmRNA水平
Fig1CalpainmRNAexpressionlevelinmacrophageafterthestimulationofLPSandIL-4

A-C:M1-type macrophage;D-F:M2-type macrophage.(1)P<0.05.

图2M1、M2型巨噬细胞各种标志物的mRNA水平
Fig2ThemRNAlevelsofmarkersinM1-typeandM2-typemacrophage

M1、M2型巨噬细胞内calpain蛋白质水平变化在M1型巨噬细胞内,calpain2蛋白质水平明显升高(P<0.05);而在M2型巨噬细胞内,calpain 2蛋白质水平却明显降低(P<0.05)。calpain1蛋白质水平在M1型和M2型巨噬细胞虽有趋势性升高,但差异均无统计学意义(图3)。

A:M1-type macrophage;B:M2-type macrophage.(1)P<0.05.

图3M1、M2型巨噬细胞内calpain蛋白质水平
Fig3ThecalpainproteinlevelsinM1-typeandM2-typemacrophage

Calpain干扰对巨噬细胞极化类型的影响利用siRNA技术体外构建calpain干扰的巨噬细胞,观察calpain对巨噬细胞极化的影响(图4)。在calpain1-siRNA组,LPS诱导巨噬细胞分泌的细胞因子IL-23、TNF-α和iNOS均减少(P<0.05);IL-4诱导巨噬细胞分泌的细胞因子TGF-β和Arg-1减少(P<0.05),而IL-10增加(P<0.05),推测calpain1可能影响巨噬细胞总数。在calpain2-siRNA组,LPS诱导巨噬细胞分泌的细胞因子IL-23、TNF-α和iNOS均减少(P<0.05);IL-4诱导巨噬细胞分泌的细胞因子TGF-β、Arg-1和IL-10均增加(P<0.05),推测calpain2可能促进巨噬细胞向M1型极化。

Calpain2干扰对巨噬细胞内NF-κB和STAT3的影响NF-κB、STAT3和JNK通路参与调控巨噬细胞极化,将巨噬细胞内calpain2干扰后再用LPS和IL-4刺激,利用Western blot观察巨噬细胞内信号通路的变化。LPS刺激组calpain2受到干扰的细胞内总磷酸化IKK蛋白质水平降低;各组细胞总p-p65蛋白质水平无明显差异,而calpain2受到干扰的细胞接受LPS刺激后与对照组相比胞质内p-p65蛋白质水平无明显降低,说明p-p65核移位减少。此外,我们发现IL-4刺激后,calpain2-siRNA组与对照组相比,胞质内STAT3蛋白质水平降低,提示STAT3核移位增加。LPS刺激的对照组和calpain2干扰组细胞磷酸化JNK蛋白质水平差异无统计学意义。因此,我们推论calpain2可能通过促进NF-κB和抑制STAT3来促进巨噬细胞向M1型极化(图5)。

Calpain影响巨噬细胞的迁移功能巨噬细胞具有迁移能力,除了calpain调控巨噬细胞极化类型,我们进一步研究了calpain对巨噬细胞移行功能的影响。利用Transwell迁移试验,我们发现calpain1和calpain2干扰组巨噬细胞,包括M0、M1、M2的迁移能力均明显下降(P<0.01,图6)。

讨 论

M1型巨噬细胞的刺激物有微生物产物LPS和Th1分泌的IFN-γ、TNF-α和 GM-CSF等。M1型巨噬细胞不仅分泌TNF-α、IL-1β和IL-6等细胞因子,还分泌趋化因子(C-X-C基序)配体 9[chemokine (C-X-C motif) ligand 9,CXCL 9]、CXCL10、CXCL5,促进Th1细胞免疫应答。M1型巨噬细胞合成环氧化酶2 (cyclooxygenase 2,COX-2)和iNOS,参与NO和活性氧的代谢,可以清除细菌、真菌、病毒,还可介导抗寄生虫、抗肿瘤反应。M1型细胞持续激活导致组织损伤、炎症并抑制修复[18-19]。

A-B:The screening results of calpain1-siRNA and calpain2-siRNA;C-D:The markers in M1-type macrophage;E-F:The markers in M2-type macrophage.(1)P<0.05.

图4calpain-siRNA干扰后巨噬细胞极化类型
Fig4Thetypeofmacrophagepolarizationaftertheinterventionofcalpain-siRNA

A:The decrease in total protein level of p-IKK was induced by LPS;B:The decrease in plasmic protein level of STAT3 was induced by IL-4.Lane 1:Control-siRNA;Lane 2:Calpain2-siRNA.

图5calpain干扰后信号通路活性变化
Fig5Activitychangeofsignalingpathwaybytheinterventionofcalpain

A:The results of migration of macrophages (×200);B:The calculation of migration of macrophages.(1)P<0.01.

图6calpain干扰巨噬细胞迁移能力的变化
Fig6Changeofthemigrationinmacrophagebyinterventionofcalpain

M2型巨噬细胞分泌细胞因子TGF-β、CCL17、CCL22和CCL24等;合成和多胺代谢有关的Arg-1,多胺是胶原合成、细胞增生和组织纤维化的必需成份。M2型巨噬细胞的主要功能是抑制炎症反应,导致组织纤维化,促进Th2免疫应答,清除寄生虫,促进血管生成和组织修复,参与免疫调节,与过敏和哮喘有关[20]。

许多转录因子介导巨噬细胞极化,其中NF-κB的 p65 调控M1型细胞的极化,巨噬细胞表面Toll样受体4 (toll-like receptor4,TLR4)与LPS结合,激活经典NF-κB通路,包括IKK磷酸化,IκBα磷酸化修饰后降解,NF-κB的p65/p50进入细胞核介导促炎因子的转录[21-22]。IL-10通过激活STAT3抑制NF-κB p65和STAT1,从而抑制M1型细胞极化[23]。本研究发现calpain1在M1型细胞内表达水平较 M2型低(P<0.05),而calpain2 在M1型细胞内表达水平与M2型相比明显升高(P<0.05)。calpain2 通过抑制STAT3促进NF-κB核移位,从而促使巨噬细胞由M0型向M1型极化。calpain1、2还能影响巨噬细胞迁移能力,对calpain1、2进行下调干预后细胞的迁移能力明显下降。

巨噬细胞受到LPS刺激后,胞质内NF-κB的p-p65减少,各组细胞总蛋白不变,意味着细胞核内p-p65增加;而巨噬细胞进行calpain2干扰后胞质内NF-κB的p-p65无明显减少,各组细胞总蛋白不变,意味着细胞核内p-p65无明显增加。NF-κB通路通过与其他转录因子相互作用介导M1型细胞极化[24],因此我们还检测了JNK和STAT3通路,发现巨噬细胞受到LPS刺激后,无论calpain2是否受到干扰,巨噬细胞内JNK磷酸化无明显差异;巨噬细胞受到IL-4刺激后胞质内STAT3减少,巨噬细胞calpain2受到干扰后胞质内STAT3进一步减少。本实验中STAT3在IL-4刺激下也能激活,与文献报道的主要通过IL-10刺激而激活的结果不同[25],其机制有待进一步研究。总之,calpain2可能通过NF-κB和 STAT3 信号通路促使巨噬细胞M0型向 M1型极化,并调控巨噬细胞的迁移。

参 考 文 献

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