小兴安岭松木醋液的生物活性及抑菌性能研究

许英梅，何德民，高连连，申东财，朴永哲，张秋民(.大连民族大学 生命科学学院，辽宁 大连 6605；.大连理工大学 化工学院，辽宁 大连 604)

抑菌剂包括无机抑菌剂、有机抑菌剂和天然抑菌剂。无机抑菌剂的主要成分是次氯酸钠(如84消毒液)、过氧化物等，有机抑菌剂的主要成分是合成苯酚类(如来苏水)、双呱类、乙基香草醛类化合物等[1-5]。天然抑菌剂主要来自天然植物的提取，如甲壳素、芥末、蓖麻油、山葵等，使用简便，但抑菌作用有限，耐热性较差，杀菌率低，不能广谱长效使用且数量很少。无机消毒剂和合成有机消毒剂虽有较强的抑菌杀菌效果，但均对人体、牲畜有较强副作用，会产生一定程度的伤害，其安全性近年来被科技界所重视。小兴安岭松木醋液是利用森林抚育的枝桠和木材加工残余物经热解制气及生物碳时的回流废液(占处理量的30%)，是含有机酸、酚、醛等多种成分的稀水溶液，不加以综合利用，不仅污染环境，还影响该行业的发展和经济效益。研究表明，精制后的木醋液不仅具有高度安全性[6-7]，而且具有较强的抑菌性[8-10]。本文以小兴安岭松木醋液为原料，研究木醋液的抑菌活性，并对活性组分加以分离，为木醋液在植物基抑菌剂的应用提供科学依据。

1 实验部分

1.1 木醋液成分分析

以小兴安岭松木醋液为原料，采用气相色谱-质谱(Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS)法分析其成分。首先对木醋液样品进行分离萃取。取待分析的木醋液样品5 mL，用无水乙醚10 mL分3次萃取，用量依次为5、3、2 mL，三次萃取后合并乙醚相，接着用适量无水氯化钙吸水干燥5 min，过滤后得到该木醋液样品的有机相，待分析。称量木醋液样品的质量和分离后的水相质量，以获得木醋液样品的有机相重量百分含量。将上述木醋液样品的有机相用甲醇(色谱纯)稀释5倍，然后进行GC-MS分析。气质联用仪(日本岛津GCMS-QP2010 Plus型)的色谱条件如下：DB-5MS毛细管色谱柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm；进样口温度230 ℃，载气He气，程序升温40～230 ℃(保持30 min)，检出器FID。质谱条件：EI源，电子能量70 eV，加速电压0.9 kV，源温230 ℃，扫描范围m/z 10～350。质谱标准库：NIST库。

1.2 化学法分离木醋液的活性组分

化学方法分离木醋液分别得到有机酸类和[有机酸类+酚类](主要是乙酸和苯酚)。先将木醋液用一定浓度的氢氧化钠溶液中和，再用无水乙醚萃取分层，最后将分层所得的水相用适量的盐酸中和还原，此时得到的水溶液即为木醋液的[有机酸类+酚类]活性组分。同理，采用一定浓度的碳酸氢钠溶液分离可得到木醋液的有机酸类活性组分。

1.3 抑菌性试验

1.3.1 培养基

(1)细菌培养基(LB)：蛋白胨10 g·L-1，酵母浸粉5 g·L-1，氯化钠10 g·L-1，琼脂20 g·L-1，去离子水1 L，pH 7.4。

(2)酵母菌培养基(Martin)：葡萄糖10 g·L-1，蛋白胨5 g·L-1，磷酸二氢钾1 g·L-1，硫酸镁0.5 g·L-1，琼脂20 g·L-1，自然pH，去离子水1 L。

(3)双层平板制备。底层：已灭菌的琼脂培养基(2.2%)10 mL，待凝固；上层：取已融化的LB培养基(琼脂含量1.8%)200 mL冷却至45 ℃左右，与指示菌1 mL(浓度为1%)混匀，快速倾入20～25 mL于底层培养基上，待凝固，作为菌层。

1.3.2 指示菌菌液的制备

以大肠杆菌为例：从大肠杆菌培养皿上挑取典型菌落接种至LB液体培养基试管中，37 ℃下摇床振荡培养24 h，得到大肠杆菌菌液，待用。其他菌种的培养方法类似，而培养条件不同。

1.3.3 抑菌试验方法

采用牛津杯法测抑菌圈直径[11-13]。在无菌操作台上，首先制作双层平板，待其凝固后将培养基平皿倒扣，在表面皿的背面标上记号，然后将牛津杯(内径6 mm、外径8 mm、高10 mm的圆形金属小管)垂放在已凝固的培养基中有标记的地方，并用镊子轻轻的按压，使牛津杯与培养基直接接触没有空隙(防止加入待测液的时候漏出)。用移液枪取待测样品并加入到牛津杯中，每个牛津杯中大约加入100 μL的待测样品。每个样品做3组对照。完成后将培养皿盖上，放置20 min左右。然后放入恒温为37 ℃的培养箱中，培养24个小时。在培养的过程中，试验菌开始生长，木醋液也呈球面开始扩散，木醋液随着扩散浓度而越来越小直至没有，所以离牛津杯一定距离的地方会有一条最低抑菌浓度带，在此范围内，试验菌不能生长，是一个透明的抑菌圈。观察实验结果，然后用直尺将抑菌圈的直径量出。

2 结果与讨论

2.1 木醋液成分的气质分析结果

通过分离萃取脱水处理后，得到木醋液的有机相，占木醋液总量的9.80%(质量分数)，有机相经过GC-MS分析，结果如图1。

由木醋液的总离子流(Total Ion Current，TIC)图，通过质谱标准谱库检索，结合人工解析，共鉴定出47种有机物见表1，包括各种有机酸、酮类、醇类、酚类、酯类及其它复杂有机化合物。

图1 木醋液的TIC图

表1 木醋液的GC-MS分析结果

续表1 木醋液的GC-MS分析结果

木醋液有机相中主要活性组分含量见表2。乙酸含量最大为37.21%(保留时间为2.855 min)，总有机酸类含量包括乙酸、丙酸、丁酸和己酸等占42.90%；苯酚含量为3.99%(保留时间为11.847 min)，2-甲氧基苯酚2.59%(保留时间为15.063 min)，还有各种甲基苯酚、二甲基苯酚、甲基甲氧基苯酚、乙基甲氧基苯酚、苯二酚等总酚类化合物占26.68%。

表2 木醋液主要活性组分的含量(有机相)

2.2 木醋液及活性组分对细菌的抑菌效果

选择四种指示菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌)试验木醋液及活性组分对细菌的抑菌效果。木醋液对细菌的抑菌结果如图2。

图2 木醋液对细菌的抑菌效果

四种指示菌对木醋液都比较敏感，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌，而大肠杆菌和普通变形杆菌属于革兰氏阴性菌，木醋液在较高浓度下对革兰氏性状不同的细菌均有明显的抑菌效果，说明木醋液具有广谱抑菌性。对应于木醋液原液浓度的抑菌效果最强，分别是对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为30 mm，对普通变形杆菌的抑菌圈直径为28 mm，对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径为22 mm，对大肠杆菌的抑菌圈直径为18 mm。四种指示菌的抑菌圈直径受木醋液稀释倍数(体积比)的影响变化趋势一致，随着稀释倍数的增大，抑菌圈直径逐渐减小，在木醋液稀释倍数为10倍之前影响幅度较大，随木醋液浓度的降低，抑菌效果明显减弱；在木醋液稀释倍数为10倍以上影响幅度很小，随木醋液浓度的降低，抑菌效果差异不大，抑菌圈直径达到最小值10 mm左右。

将木醋液用化学法分离，分别得到两组活性组分有机酸类和[有机酸+酚类]，通过对四种指示菌的抑菌性试验，抑菌效果如图3。

抑菌效果受稀释倍数的影响趋势都与木醋液类似，但抑菌效果明显不同。例如对属于革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌效果显示，有机酸类的最大抑菌圈直径分别为28 mm和18 mm，而[有机酸类+酚类]的最大抑菌圈直径分别为30 mm和22 mm；属于革兰氏阴性菌的大肠杆菌和普通变形杆菌的抑菌效果显示，有机酸类的最大抑菌圈直径分别为14 mm和24 mm，而[有机酸类+酚类]的最大抑菌圈直径分别为17 mm和26 mm。木醋液活性组分[有机酸类+酚类]的抑菌效果普遍高于有机酸类，说明木醋液的抑菌活性组分不只是有机酸类，而是[有机酸类+酚类]。

图3 木醋液活性组分对细菌的抑菌效果

将市售84消毒液和来苏水按照使用浓度测定其对大肠杆菌和普通变形杆菌的抑菌圈直径，并与木醋液进行比较，结果如表3。木醋液的抑菌效果优于市售84消毒液和来苏水，是一种很有应用前景的植物基抑菌剂。

表3 不同抑菌剂的抑菌圈直径

3 结 论

(1)采用GC-MS分析法分析了木醋液中的有机相成分，有机相中乙酸含量最大为37.21%，总有机酸类含量包括乙酸、丙酸、丁酸和己酸等占42.90%，苯酚含量为3.99%，各种甲基苯酚、二甲基苯酚、甲基甲氧基苯酚、乙基甲氧基苯酚、苯二酚等总酚类化合物占26.68%。

(2)采用牛津杯法选择四种指示菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌)研究木醋液及分离活性组分对细菌的抑菌效果，在较高浓度下对革兰氏性状不同的细菌均有明显的抑菌效果，活性组分[有机酸类+酚类]的抑菌效果普遍高于有机酸类。木醋液的抑菌活性组分不只是有机酸类，而是[有机酸类+酚类]，以有机酸为主，酚类为辅。木醋液作为植物基抑菌剂，其抑菌效果优于次氯酸钠等化学品类消毒液。

参考文献：

[1] KUPPUSAMY S , THAVAMANI P , MEGHARAJ M, et al. Bioremediation potential of natural polyphenol rich green wastes: A review of current research and recommendations for future directions [J] Environmental Technology & Innovation， 2015, 4：17-28.

[2] DAS R, DUTTA A, BHATTACHARJEE C. Preparation of sesame peptide and evaluation of antibacterial activity on typical pathogens [J]. Food Chemistry，2012, 131:1504-1509.

[3] GUO B , FAN H X , XIN Q S, et al. Synthesis and biological evaluation of novel benzoxazinyl-oxazolidinones as potential antibacterial agents [J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，2013, 23：3697-3699.

[4] ZHANG J , ZHAO J W , Wang L P , et al. Design, synthesis and docking studies of some spiro-oxindole dihydroquinazolinones as antibacterial agents [J]. Tetrahedron， 2016, 72:936-943.

[5] CHHABRA M , SINHA S, BANERJEE S, et al. An efficient green synthesis of 2-arylbenzothiazole analogues as potent antibacterial and anticancer agents [J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters， 2016, 26：213-217.

[6] 张善玉,金光洙,金在久，等. 精制木醋液的安全性评价[J].中国野生植物资源，2005,24(2)：54-55.

[7] 陈顺伟,邵素芬,庄晓伟，等. 精制竹醋液的安全性毒理学评价[J].竹子研究汇刊，2007,26(3)：41-44.

[8] 尉芹,马希汉,郑滔. 核桃壳木醋液的制取、成分分析及抑菌试验[J]. 农业工程学报，2008，24(7) :276-279 ．

[9] 毛巧芝,赵忠,马希汉. 杏树枝木醋液的制取及其抑菌活性和化学成分分析[J].西北农林科技大学学报: 自然科学版，2009，37(10)：91-96.

[10] WEI Q, MA X H, DONG J E. Preparation, chemical constituents and antimicrobial activity of pyroligneous acids from walnut tree branches[J]. J. Anal. Appl. Pyrolysis，2010，87：24-28．

[11] 赵斌,林会,何绍江. 微生物学实验[M]. 北京:科学出版社,2014:38.

[12] 周德庆,徐德强. 微生物学实验教程[M]. 北京:高等教育出版社,2013:7.

[13] TALARO K P, CHESS B. Foundations in microbiology basic principles[M]. Beijing:Higher Education Press，2013:1.