影响金针菇菌丝体及胞外多糖产量的因子研究

李福后，王伟霞，刘伟

（1.淮海工学院海洋生命与水产学院，江苏连云港222005；2.连云港可为食用菌有限公司，江苏连云港223500）

金针菇（Flammulina velutipes），又名冬菇、朴菇、毛柄金钱菌，隶属于伞菌目、口蘑科、金钱菌属，其肉质细腻，味道宜人，富含精氨酸、赖氨酸等多种必需氨基酸，以及维生素B1、维生素B2、维生素C、维生素PP等[1-3]。金针菇还含有多糖、蛋白聚糖、糖蛋白、倍半萜等多种活性物质，具有抗肿瘤、促进智力发育、提高免疫力、预防和治疗肝脏疾病和胃溃疡等作用，是一种理想的保健食品[4-5]。

近年来，消费者对金针菇的需求与日俱增，如何进一步提高金针菇的产量和品质成为当前重要的研究方向。植物激素和壳聚糖作为常见的生长调节剂，对食用菌生长发育具有明显的影响[6-9]，在液体菌种生产、多糖制备等领域具有潜在的应用价值。本文以工厂化栽培菌株为材料，研究不同种类和不同浓度的植物激素、壳聚糖对金针菇菌丝体生长以及胞外多糖产量的影响；以期为植物激素、壳聚糖等生长调节剂在液体菌种生产、多糖制备等领域应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种：金针菇kw02，由连云港市某食用菌有限公司提供；生长调节剂[赤霉素、萘乙酸（naphthylacetic acid，NAA）、 二 氯 苯 氧 乙 酸（Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D）等激素]：生工生物（上海）股份有限公司，均为分析纯；壳聚糖（脱乙酰度≥90%）：连云港澳新生物工程有限公司。

1.2 培养基设计

1）固体培养基：以PDA培养基为基础，分别加入不同浓度的植物激素。赤霉素使用浓度为0、5、10、15、20 mg/L。NAA 使用浓度为0、2、4、6、10 mg/L。2，4-D 使用浓度为0、5、10、15、30 mg/L。

2）液体培养基：葡萄糖30 g，蛋白胨2 g，酵母粉5g，KH2PO40.5g，MgSO40.5g，，蒸馏水 1000mL。

3）壳聚糖母液制备：参考李辉的方法[10]，配置0.5%壳聚糖溶液，pH 6.0。壳聚糖使用浓度分别为为0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125 mg/mL。

1.3 固体培养方法

利用打孔器从长满金针菇菌丝体的平板上选取菌种块，然后接种到添加了植物激素的固体培养基上，25℃培养。分别于培养3 d和7d后测量菌落的直径，计算菌丝生长速度。

1.4 液体培养方法

种子液的制备：将100 mL液体培养基分装于250 mL三角瓶，灭菌后备用。利用打孔器从长满金针菇菌丝体的平板上选取大小约0.5 cm2的菌种块，接种于三角瓶中，每瓶5块，25℃，120 r/min，培养5 d。然后利用磁力搅拌器将成团的菌块打碎，继续培养3 d后作为种子液使用。

发酵液的制备：采用100 mL液体培养基，分别加入一定量的植物激素或壳聚糖溶液，以不添加植物激素或壳聚糖溶液的发酵培养基作为对照，每个处理组设3次重复。取种子液接种于液体发酵培养基中，接种量5%，然后置于摇床中，25℃，120 r/min，培养7 d。

指标测定：发酵结束后，10 000 r/min离心5min，上清液用于胞外多糖的测定。沉淀物为菌丝体，蒸馏水冲洗2次后，80℃烘干至恒重，称量得菌丝体干重。

1.5 胞外多糖的测定

胞外多糖的测定采用蒽酮-硫酸法，在620 nm处测定吸光值[11]。根据葡萄糖浓度与吸光值的关系制作葡萄糖标准曲线，其回归方程为y=0.012 3x+0.058 2，相关系数r=0.999 749。取离心后的上清液，首先测定总糖含量，然后加入乙醇至浓度为80%，置于4℃沉降24 h，离心后，测定上清液的还原糖含量，二者之差即为胞外多糖的含量。

2 结果与分析

2.1 金针菇菌株kw02的菌落特征和菌丝形态

金针菇菌株kw02的菌落特征和菌丝形态见图1。

图1 金针菇菌株kw02的菌落特征和菌丝形态Fig.1 Colony characteristics and mycelial morphology of strain kw02

kw02的菌落特征见图1a，其菌丝洁白、浓密，气生菌丝发达，生长速度快。采用插片培养法，置于光学显微镜下观察菌丝形态（10×40倍），发现菌丝粗壮，分支多，且锁状联合较多（图1b）。

2.2 植物激素对金针菇菌丝体生长的影响

植物激素对金针菇菌丝体生长的影响结果见图2。

在试验浓度范围内，赤霉素对菌株kw02的菌丝体生长具有促进作用，以10 mg/L为最适浓度，菌丝生长速度提高22.7%以上。

低浓度的萘乙酸对菌丝体生长有刺激作用，与对照组相比，4 mg/L和6 mg/L萘乙酸能够促进菌丝生长，菌丝生长速度分别提高2.5%和13.3%，而10 mg/L萘乙酸则抑制菌丝生长。

图2 植物激素对金针菇菌丝体生长的影响Fig.2 The effect of plant hormones on mycelia growth of Flammulina velutipes

低浓度的2，4-D对菌丝体生长也有促进作用，以5 mg/L为最适供试浓度，而30 mg/L 2，4-D则抑制菌丝生长。

2.3 植物激素对金针菇胞外多糖产量的影响

金针菇多糖具有抗肿瘤和免疫调节作用，而提高多糖产率是金针菇资源开发的重要方向之一[12]。植物激素对金针菇胞外多糖产量的影响见图3。

图3 植物激素对金针菇胞外多糖产量的影响Fig.3 The effect of plant hormones on exopolysaccharide content of Flammulina velutipes

赤霉素对金针菇胞外多糖产量具有明显的影响，在试验浓度范围内，胞外多糖产量呈现先升高后下降的趋势，在浓度为5 mg/L时，胞外多糖产量最高，而随着赤霉素浓度的升高，胞外多糖产量逐渐下降。

萘乙酸对金针菇胞外多糖产量也有明显的影响，在浓度为4 mg/L时，胞外多糖产量最高，是对照组的2倍多；而萘乙酸浓度大于6 mg/L时，胞外多糖产量迅速下降。

与赤霉素作用类似，2，4-D在试验浓度范围内，胞外多糖产量也呈现先升高后下降的趋势，在浓度为10 mg/L时，胞外多糖产量最高；而随着激素浓度升高，胞外多糖产量逐渐下降。

2.4 壳聚糖对金针菇菌丝体生长的影响

壳聚糖对金针菇菌丝体生长的影响结果见图4。

图4 壳聚糖对金针菇菌丝体生长的影响Fig.4 The effect of chitosan on mycelia growth of Flammulina velutipes

由图4可知，适量浓度的壳聚糖有利于菌丝体的生长；与对照组相比，壳聚糖浓度在0.05 mg/mL～0.1 mg/mL范围内，菌丝体生长速度都有明显的提高，当浓度为0.075 mg/mL时，菌丝体生物量最大，比对照组提高34%。当浓度超过0.125 mg/mL时，菌丝体生长明显下降；当壳聚糖浓度为0.15 mg/mL时，发现三角瓶内出现了较多的壳聚糖沉淀，这些沉淀可能影响了菌丝体的生长。

2.5 壳聚糖对金针菇胞外多糖产量的影响

壳聚糖对金针菇胞外多糖产量的影响结果见图5。

由图5可知，壳聚糖浓度在0.025 mg/mL～0.075 mg/mL范围内，对金针菇胞外多糖产量基本没有影响，表明低浓度的壳聚糖虽然能够促进菌丝体生长，但不能促进菌丝体分泌胞外多糖。当壳聚糖浓度超过0.1 mg/mL时，发现胞外多糖产量明显下降，表明高浓度的壳聚糖能够抑制菌丝体分泌胞外多糖。

图5 壳聚糖对金针菇胞外多糖产量的影响Fig.5 The effect of chitosan on exopolysaccharide content of Flammulina velutipes

3 讨论

植物激素作为痕量信号分子，能够调控植物的生长发育过程和环境应答过程，为农作物的化学控制、农业的发展做出了重要贡献[13-17]。研究表明，许多植物激素也能够调控食用菌子实体的生长发育，在食用菌栽培领域具有潜在的应用价值[18-20]。

不同菌种和同一菌种不同菌株对激素处理的表现具有明显不同，以赤霉素处理为例，王谦等发现当培养基中赤霉素浓度为1.0 mg/L，金福菇菌丝生长速度最快[21]；侯集瑞等发现5 mg/L赤霉素最能促进羊肚菌菌丝生长[22]；王言等发现0.005%浓度赤霉素（50 mg/L）对金针菇G1的促生长效果最显著，而赤霉素对金针菇F29未表现出促生长作用（高浓度时表现抑制作用）[6]；我们发现，10 mg/L赤霉素最能促进金针菇kw02的菌丝生长。

植物激素对食用菌胞外多糖产量也有一定的影响，在试验浓度范围内，我们发现低浓度的植物激素有利于菌丝体分泌胞外多糖，表明植物激素可能能够改变细胞膜的通透性。

壳聚糖作为一种植物生长调节剂，能调节植物生长发育，提高抗性，研究表明，壳聚糖能够在转录和翻译水平上对基因表达进行调控，从而增加产量和提高品质[23-24]。壳聚糖对食用菌可能具有类似的作用，通过在转录和翻译水平上调控基因表达，从而调节菌丝体的生长发育过程。

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