超声预处理对β-伴大豆球蛋白酶解物抗氧化性的影响

张晓松，吴明亮，金花

（东北农业大学理学院，黑龙江哈尔滨150030）

自由基及其诱导的氧化反应是引起机体衰老、癌变和其他多种疾病的主要起因之一[1]。抗氧化剂有利于减少自由基的产生或加速其清除，可对抗由自由基产生的副作用，对健康非常有益[2]。目前，人们已从多种植物和动物组织中提取出效果优良的天然抗氧化剂，并且已应用于各种食品加工工业中[3－4]。研究表明，大豆蛋白经酶水解后，其产物大豆肽的抗氧化、降血压、提高免疫力的能力均会有效增强[5]。此外，β－伴大豆球蛋白还是一种糖蛋白，这使得β－伴大豆球蛋白的营养和生理功能有异于单纯的多肽，能够在生物体中发挥着十分重要的作用[4]。因此，关于β－伴大豆球蛋白酶解物的生物活性研究，对充分利用大豆蛋白资源具有重要意义。

超声波是高于人类听觉阈值频率（＞16 kHz）的机械波，可用于食品物理或化学性质的改变，其在食品工业中的应用受到了广泛的关注[6－7]。Hu等[8]研究发现超声预处理能明显降低大豆分离蛋白分散体的稠度系数，增加大豆分离蛋白流变性能和微观结构的聚集。Jiang等[9]发现超声预处理可破坏黑豆蛋白的内部结构，使蛋白分子伸展，改善黑豆蛋白的功能特性。Xu等[10]研究发现超声预处理可提高高变性豆粕酶解物的抗氧化活性。目前许多研究已经报道了超声预处理对蛋白质结构和功能特性的影响，但是以β－伴大豆球蛋白为研究对象，研究超声预处理前后β－伴大豆球蛋白结构的变化，探讨其对酶解物抗氧化活性改变的影响机理的报道较少。

因此，本文旨在研究超声预处理对β－伴大豆球蛋白结构及其酶解物抗氧化活性的影响，并通过比较超声预处理前后β－伴大豆球蛋白结构的变化，探讨超声预处理提高β－伴大豆球蛋白酶解物抗氧化活性的机理。本研究对提高β－伴大豆球蛋白酶解效率，改善β－伴大豆球蛋白酶解物抗氧化活性，为提高大豆蛋白资源利用率提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

低温脱脂豆粕[蛋白质量分数为（50.5± 0.6）%，干基]：哈高科大豆食品有限责任公司；碱性蛋白酶（酶活力为2.0×105U/g）：北京奥博星生物技术有限责任公司；十二烷基硫酸钠（dodecyl sulfate，SDS）、标准蛋白样品、8－苯胺基－1－萘磺酸（8－anilino－1－naphthalenesulfonic acid，ANS）：美国 Sigma 公司；所有分离用有机溶剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

凯氏定氮仪（K9840）：济南海能仪器有限公司；电泳系统（Mini－protean IV）：美国 Bio－Rad 公司；超声波细胞粉碎机（JY92－2D）：宁波新芝生物科技股份有限公司；双光束紫外可见分光光度计（TU－1901）：北京普析通用仪器有限责任公司；拉曼光谱仪（Raman Station 400）：美国PerkinElmer公司；荧光分光光度计（F－4500）：日本 Hitachi公司；自动电位滴定仪（TIM840）：美国Radiometer公司；冷冻干燥机（FD5－3）：美国 SIM公司。

1.3 方法

1.3.1 β－伴大豆球蛋白的制备

采用优化Nagano法[11]分离提取β－伴大豆球蛋白，其具体流程见图1。

图1 β-伴大豆球蛋白制备流程图Fig.1 Process diagram of β-conglycinin in the process of preparation

1.3.2 β－伴大豆球蛋白的表征

采用不连续SDS－PAGE电泳方法[12]，分别配置5%的分离胶与12%的浓缩胶，上样量为10 μL。初始电泳电压为80 V，当样品达到分离胶后电压改为120 V，结束后取出胶片用考马斯亮蓝R－250染色，然后用甲醇/冰醋酸脱色，对电泳图谱进行分析。采用BandScan 5.0软件对SDS－PAGE谱带进行分析，β－伴大豆球蛋白纯度达到82.9%。

1.3.3 超声预处理

参照Hu等[13]方法，略有改动。将β－伴大豆球蛋白与蒸馏水以3 g：100 mL的比例混合于100 mL锥形瓶中，室温下不断搅拌1 h，然后将超声波处理器的钛探头（直径=0.6 cm）插入液面下，距离锥形瓶底部1 cm处，在20 kHz下进行超声预处理。改变不同超声功率（100、300、500 W），超声时间（10、30、50min）和超声温度（40、50、60℃），具体条件见表1，并研究各条件参数对β－伴大豆球蛋白酶解物抗氧化活性的影响。经超声处理后，样品在－40℃预冻24 h，然后把预冻样品放入冷冻干燥机中冷冻，直至样品完全干燥。将冻干样品密封于4℃下保存备用。

表1 β-伴大豆球蛋白超声预处理方式Table 1 Ultrasound pretreatment parameters of β-conglycinin

1.3.4 紫外光谱的测定

参照涂宗财等的方法[14]，称取一定量的蛋白样品，溶于 0.01 mol/L 磷酸缓冲液（pH 7.0）中，采用 Lowry法测定样品蛋白质含量，将待测液的蛋白浓度稀释至0.2 mg/mL，用于紫外光谱分析。波长范围为220 nm～360 nm，分辨率为0.2 nm，扫描速率为50 nm/min。

1.3.5 拉曼光谱的测定

参照Wong等的方法[15]，将蛋白样品直接平铺在载玻片上进行拉曼光谱测定。在室温下，测量方式如下：激发光波长为785 nm，激发功率为40 mW/cm，分辨率扫描范围为400 cm－1～2 000 cm－1，扫描次数为3 次以上，通过计算机对信号累加平均输出样品的拉曼光谱图，峰位误差小于±3 cm－1。利用 Origin 8.0 软件对拉曼数据进行平滑处理，校正基线后采用苯丙氨酸（1 003±1）cm－1作为归一化因子，以此作为各拉曼峰强度变化的依据，蛋白质二级结构组分的定量分析采用Peakfit 4.12软件进行拟合。

1.3.6 表面疏水性（H0）的测定

参照Alizadeh等的方法[16]，测定蛋白样品的表面疏水性。称取25 mg样品溶于50 mL磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.0）中，在室温条件下磁力搅拌 30min，4 000 r/min离心20min，取上清液备用。上清液被磷酸盐缓冲溶液稀释成蛋白浓度为0.005 mol/mL到0.5 mol/mL的溶液，取上述浓度范围的蛋白样品溶液4 mL，加入浓度为8 mmol/L的 ANS溶液 40 μL，充分振荡后，静置3min，测定蛋白样品的荧光强度。激发波长为390 nm，发射波长为470 nm，夹缝为5 nm。蛋白质的表面疏水性指数（H0）通过作图法求得，采用荧光强度对蛋白质浓度作图，初始段斜率为表面疏水性指数（H0）。

1.3.7 β－伴大豆球蛋白的酶解工艺

称取一定量的β－伴大豆球蛋白配成底物浓度为3%的溶液，采用碱性蛋白酶进行酶解[17]，加酶量24 000 U/g底物，pH 9.0，温度 45℃、酶解时间 4 h，加入 1.00 mol/L 的 NaOH，使系统保持在 pH 9.0。反应结束后，沸水浴灭酶活10min。冷却，添加1.00 mol/LHCl调pH至4.3，4 000 r/min离心15min。收集上清液，冷冻干燥，将冻干样品于4℃下保存备用。

1.3.8 羟自由基清除率的测定

参照Amarowicz等的方法[18]，略有改动。取1.00 mL酶解液样品加入1.00 mLFeSO4（3 mmol/L）和1.00 mL H2O2（3 mmol/L），置于暗处反应10min，再加入1.00 mL水杨酸乙醇溶液（3 mmol/L），置于暗处反应30min，在510 nm处测定吸光度。

按照以下公式计算羟自由基清除率：

羟自由基清除率/%=[1－（Ai－Aj）/A0]×100

式中：Ai为加入 1.00 mL 样品、1.00 mL FeSO4和1.00 mL H2O2、1.00 mL 水杨酸乙醇溶液时测定的吸光度；Aj为以1.00 mL超纯水代替水杨酸乙醇溶液时测定的吸光度；A0为以1.00 mL超纯水代替样品时测定的吸光度。

1.3.9 还原能力的测定

参照Yu等[19]的方法测定还原能力。取1 mL酶解液样品加入 0.2 mol/L pH 6.6 的磷酸盐缓冲液 2.50 mL和 1%（质量分数）K3Fe（CN）6溶液 2.50 mL，摇匀，50℃保温20min，冰水浴迅速冷却。加入10%（质量分数）三氯乙酸溶液2.5mL，3 500 r/min 离心 10min。取 2.5mL上清液，加 2.5 mL 超纯水和 0.5 mL 0.1%（质量分数）氯化铁溶液，混匀静置10min。以超纯水代替样品调节零点，在700 nm波长处测定吸光度，吸光度与样品还原能力成正相关。

1.3.10 Fe2+螯合能力的测定

参照Amarowicz等的方法测定Fe2+螯合能力。取1 mL酶解液样品加入3.7mL超纯水和0.1mL20mmol/L FeCl2，静置 3min，加入 0.2 mL 5 mmol/L 菲洛嗪混合10min，在562 nm处测定吸光度。

以螯合能力（%）表示，计算公式为：

螯合能力/%=（1－Ai/A0）×100

式中：Ai为1 mL 样品加入 3.7 mL 超纯水和 0.1 mL FeCl2和0.2 mL菲洛嗪时测定的吸光度；A0为以1 mL超纯水代替1 mL样品后测定的吸光度。

1.3.11 数据处理

本试验所有结果均表示为平均数±s，每个试验数据重复测定3次。采用SPSS17.0软件分析数据间的显著性差异，p ＜0.05 为差异显著。采用 Origin8.5 软件、PeakFit 4.12软件等进行数据分析，图表处理及图谱分析处理。

2 结果与分析

2.1 超声预处理对β－伴大豆球蛋白紫外光谱影响的分析

蛋白质中的色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、组氨酸和苯丙氨酸残基侧链基团对紫外光有吸收作用，不同的氨基酸有不同的生色基团。其中，色氨酸和酪氨酸的紫外吸收峰在280 nm附近，苯丙氨酸的紫外吸收峰在257 nm附近。因此，紫外光谱可用来研究蛋白质侧链的变化，探讨超声预处理对β－伴大豆球蛋白三级结构的影响。根据蛋白质对紫外光谱吸收的不同，可以推断蛋白质分子在溶液中构象的变化[20]。

超声预处理对β－伴大豆球蛋白紫外光谱的影响见图2。

图2 不同超声预处理条件β-伴大豆球蛋白的紫外光谱Fig.2 UV spectra of β-conglycinin with different ultrasoundtreated

从图2可以看出，β－伴大豆球蛋白溶液经不同超声功率、时间、温度预处理后，峰位没有位移，峰型无明显区别。但相比未超声预处理的β－伴大豆球蛋白（A－7S）样品，超声预处理的β－伴大豆球蛋白在280 nm附近的吸收峰都有所增强，说明超声预处理可增加β－伴大豆球蛋白的紫外吸收。这可能是由于超声波的机械作用力破坏了致密的蛋白质结构，导致超声预处理后β－伴大豆球蛋白侧链发生了变化。与未处理的β－伴大豆球蛋白溶液相比，超声预处理后的β－伴大豆球蛋白溶液中，增加了具有紫外吸收的芳香族氨基酸残基，如酪氨酸、色氨酸残基等，提高了蛋白样品在紫外光谱中吸收峰的强度[21]。

2.2 超声预处理对β－伴大豆球蛋白拉曼光谱影响的分析

拉曼光谱是一种研究分子振动的散射光谱，通过拉曼光谱不同的散射、吸收峰位置、退偏比和强度，可以推测蛋白质的构型或者构象的变化。从蛋白样品的拉曼光谱中，我们可以获得蛋白质主链（酰胺Ⅰ带的二级结构）和侧链（酪氨酸和色氨酸等）的结构信息，以及蛋白质的微环境变化。通过对蛋白样品拉曼光谱的分析，可以研究在变性和聚合过程中蛋白质结构的变化[22]。

2.2.1 对β－伴大豆球蛋白主链结构的影响

β－伴大豆球蛋白的构象主要由拉曼光谱中酰胺Ⅰ带的C=O与C－N键的伸张来确定。参考已有研究，拉曼特征峰位置各子峰与二级结构对应关系为：酰胺Ⅰ带中无规则卷曲结构对应的子峰为1 640 cm－1～1 645 cm－1和 1 660 cm－1；α－螺旋结构对应的子峰为1 645 cm－1～1 655 cm－1；β－折叠结构对应的子峰为1 665 cm－1～1 680 cm－1；β－转角结构对应的子峰为1 680 cm－1～1 690 cm－1[23]。

蛋白质的酰胺I带常被用于蛋白质的主链二级结构表征，酰胺I带中主要涉及C=O伸缩振动和部分肽键间的N－H内部弯曲振动。蛋白质的酰胺I带二级结构相对含量的定量分析结果如表2所示。

表2 拉曼光谱测定不同超声预处理β-伴大豆球蛋白二级结构的含量Table 2 Secondary structural content of β-conglycinin with ultrasound-treated estimated from Raman spectra%

由表2可知，不同超声预处理条件下β－伴大豆球蛋白的拟合分析结果表明，β－折叠结构为含量最多的二级结构单元。与未进行超声预处理的β－伴大豆球蛋白（A－7S）相比，经过不同超声预处理的β－伴大豆球蛋白样品均表现出β－转角结构和α－螺旋结构含量增加，β－折叠结构含量减少的趋势。其中α－螺旋结构含量最多增加3.14%，β－转角结构含量最多增加1.22%，β－折叠结构含量最多减少4.17%。这一结果说明超声波所引起的空穴效应使得蛋白质分子的交互作用受到破坏，维持蛋白质高级结构的次级键断裂，蛋白质分子展开，发生解聚和重排，导致β－伴大豆球蛋白的二级结构发生改变。另外，研究表明降低的β－折叠结构含量说明蛋白质疏水相关位点暴露，暴露的疏水性氨基酸残基能促进抗氧化肽与疏水性多不饱和脂肪酸相互作用，抑制脂质过氧化[24]，由此可见，经超声处理后蛋白质的抗氧化性会有所提高。

2.2.2 对β－伴大豆球蛋白侧链结构的影响

色氨酸在拉曼光谱图上会表现出多个拉曼光谱带，对于观察蛋白质微环境的极性及氢键变化规律有着重要作用。Wong等[25]研究表明在760 cm－1附近的拉曼峰强度降低与疏水性色氨酸残基由包埋转变为暴露到极性微环境有关。本试验中，经过超声预处理的β－伴大豆球蛋白的拉曼图谱，在760 cm－1附近区域的拉曼峰强度有所降低，该区域归属于色氨酸残基的伸缩振动。结果表明，经过超声预处理后色氨酸残基由包埋的疏水微环境转为暴露的展开形式，其中经超声预处理的 β－伴大豆球蛋白（B－7S）样品，在 760 cm－1附近区域的拉曼峰强度相对降低较大（p＜0.05，n=3），说明在此条件下疏水氨基酸基团暴露明显。

酪氨酸侧链微环境改变时，由于其苯环的吸收振动和面外弯曲振动会导致在 830 cm－1、850 cm－1附近的特征峰发生变化。特征峰850 cm－1和830 cm－1的强度比（I850/I830）可以反映酪氨酸侧链中酚羟基离子化状态或者氢键的性质，两者的比值已广泛应用于辨别酪氨酸残基暴露和埋藏的程度。当酪氨酸残基趋向于“暴露”态时，I850/I830在 1.25～1.40 范围内；当酪氨酸残基趋向于“包埋”态时，I850/I830在 0.3～0.5 范围内；当酪氨酸残基呈电离态时，I850/I830比值为0.7。特征峰850 cm－1和830 cm－1的强度比（I850/I830），还能够提供酪氨酸是氢键的受体还是氢键的供体方面的信息。当二者的相对强度比（I850/I830）为最小值0.3时，表明酪氨酸的苯环上的羟基氧原子是强氢键的供体，如羧基氧。当酪氨酸暴露到蛋白表面，环上的羟基氧原子同时作为中等强度氢键供体和受体，这时I850/I830的比值为1.25。当二者的相对强度比（I850/I830）为2.5时，说明酪氨酸的苯环上的羟基氧原子是强氢键的受体[26]。

本试验中，I850/I830的比值范围为1.006～1.027，表明不同超声预处理的β－伴大豆球蛋白的酪氨酸暴露到溶液的极性微环境中，并同时作为中等强度氢键的供体或受体。

不同超声预处理β－伴大豆球蛋白色氨酸（760cm－1）、酪氨酸（I850/I830cm－1）及 C－H 振动（1 450 cm－1）谱带强度见表3。

由表3可知，与未超声预处理的β－伴大豆球蛋白相比，经过不同超声预处理的β－伴大豆球蛋白的酪氨酸双峰比值有所增加（p＜0.05，n=3），这说明超声预处理破坏了维持β－伴大豆球蛋白三级结构的氢键，使酪氨酸残基从疏水环境的内部展露到分子的表面，同时作为氢键的受体或供体与水发生相互作用，同时酪氨酸残基暴露使850 cm－1处条带强度比830 cm－1处条带强度增强，同时增加蛋白质的表面疏水性。

CH2和CH3的弯曲振动在拉曼光谱中1 450 cm－1附近可以观察到[27]。与未超声预处理的β－伴大豆球蛋白（A－7S）相比，超声预处理的β－伴大豆球蛋白拉曼光谱中1 450 cm－1处的谱带强度增加，超声预处理的β－伴大豆球蛋白 B－7S样品（100 W，30min，50℃）谱带强度达到最大值。在1 450 cm－1处C－H键强度的增加与疏水基团暴露到极性环境的增加有关。通过拉曼光谱对β－伴大豆球蛋白侧链结构的分析，说明在低超声强度下蛋白质解聚，疏水性氨基酸暴露，当超声强度进一步增加时，蛋白聚集导致微环境和极性的改变，使疏水基团向包埋和微极性环境转变，使谱带强度降低。

表3 不同超声预处理β-伴大豆球蛋白色氨酸（760 cm-1）、酪氨酸（I850/I830cm-1）及 C-H 振动（1 450 cm-1）谱带强度Table3 Normalizedintensitiesofthetryptophanband（760cm-1），the fermi-resonance doublet（I850/I830cm-1）of tyrosine and C-H band（1 450 cm-1）of β-conglycinin with different ultrasoundtreatment

2.3 超声预处理对β-伴大豆球蛋白表面疏水性影响的分析

表面疏水性（H0）是蛋白质重要的功能性质，同时也是衡量蛋白质分子表面疏水基团数目的指标。表面疏水作用决定了蛋白质的构象，功能性和稳定性，是维持蛋白质三级结构的主要作用力，在维持蛋白质三级结构的稳定性和四级结构的形成中占有突出的地位。相关报道显示超声作用能够增加多种蛋白质的表面疏水性，如大豆分离蛋白，乳清蛋白和卵白蛋白[27-28]。不同超声预处理的β-伴大豆球蛋白的表面疏水性测定结果，见图3。

图3 不同超声预处理条件β-伴大豆球蛋白的表面疏水性Fig.3 Surface hydrophobicity of β-conglycinin with different ultrasound-treated

与未超声预处理的β-伴大豆球蛋白相比，经过超声预处理的β-伴大豆球蛋白的表面疏水性显著升高（p＜0.05，n=3）。β-伴大豆球蛋白的表面疏水性随超声功率和温度的升高，逐渐增大；随着超声时间的延长，呈现先增大后减小的趋势。超声预处理提高β-伴大豆球蛋白表面疏水性的原因主要有两个：第一，超声预处理能够使β-伴大豆球蛋白的疏水基团从分子内部暴露到分子表面；第二，经过超声预处理之后，β-伴大豆球蛋白的粒度降低，空穴效应对β-伴大豆球蛋白聚集物产生了解聚作用，解聚过程中让更多的疏水基团暴露在环境中增加蛋白质的表面疏水性[29]。

2.4 超声预处理对β-伴大豆球蛋白酶解物抗氧化活性影响的分析

不同超声预处理条件对β-伴大豆球蛋白酶解物羟自由基清除率、还原能力和亚铁离子螯合能力的影响，如图4所示。

与未超声预处理的β-伴大豆球蛋白酶解物相比，超声预处理的β-伴大豆球蛋白酶解物羟自由基清除率、还原能力和亚铁离子螯合能力显著升高（p＜0.05，n=3）。由图4可见，随着超声功率的增加，酶解物的抗氧化性逐渐减小；与之不同，随着超声时间和超声温度的增加，酶解物的抗氧化性先增加后减小。超声预处理的β-伴大豆球蛋白（B-7S）经蛋白酶水解后羟自由基清除率、还原能力和亚铁离子螯合能力均为最强。

图4 不同超声预处理条件β-伴大豆球蛋白酶解物的抗氧化性Fig.4 Antioxidant activity of β-conglycinin hydrolysate with different ultrasound-treated

通过对本试验结果的分析，我们可以知道超声预处理后β-伴大豆球蛋白的结构会发生显著变化。研究表明，底物蛋白的结构对蛋白酶解物的抗氧化活性有一定的影响[30]。当β-伴大豆球蛋白经过超声功率100 W，超声时间30min，超声温度50℃处理（B-7S）后，结构变化最显著且其酶解物抗氧化活性最高。通过对不同超声预处理条件下β-伴大豆球蛋白的紫外光谱、拉曼光谱以及表面疏水性分析可知，由于超声波的空穴作用及机械作用打乱了蛋白质的致密结构，使得蛋白质的疏水位点暴露，如酪氨酸、色氨酸等从蛋白分子内部展露到分子的外部，提高了蛋白质的表面疏水性。超声预处理的β-伴大豆球蛋白（B-7S）中酪氨酸和色氨酸暴露在蛋白质分子表面最显著（p＜0.05，n=3），酶解后容易得到侧链中含有酪氨酸和色氨酸残基的酶解物。酪氨酸和色氨酸可以向自由基提供氢原子，减慢或终止自由基链反应，提高物质的抗氧化活性[31]。超声预处理的β-伴大豆球蛋白酶解物抗氧化活性提高也可能是由于超声预处理改变了蛋白质的高级结构，更容易被酶水解，水解度增大，水解得到更多的小分子肽，提高了物质的抗氧化活性。

3 结论

本文研究表明β-伴大豆球蛋白经过超声预处理后采用碱性蛋白酶水解，其酶解产物与未经超声预处理的酶解产物相比，具有明显增强的抗氧化活性，其中超声功率为100 W，超声时间为30min，超声温度为50℃（B-7S）时，β-伴大豆球蛋白抗氧化性最高。通过研究比较预处理前后β-伴大豆球蛋白的结构变化，发现超声预处理增加了β-伴大豆球蛋白的紫外吸收，使其α-螺旋结构含量最多增加3.14%，β-转角结构含量最多增加1.22%，β-折叠结构含量最多减少4.17%，促使疏水性氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等）暴露，增加了蛋白的表面疏水性。超声预处理后，β-伴大豆球蛋白发生解聚，疏水性氨基酸暴露在蛋白分子表面，利于蛋白酶水解获得高抗氧化活性物质。综上所述，经过超声预处理的β-伴大豆球蛋白酶解物具有优异的抗氧化能力，可以用于天然抗氧化剂的开发利用。超声预处理是一种辅助提高β-伴大豆球蛋白酶解产物抗氧化能力行之有效的方法。但超声预处理后β-伴大豆球蛋白究竟形成了怎样一种易于酶解的结构尚不清楚，有待于进一步研究。

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