茶树炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides和C. acutatum的生物学特性比较及致病毒性初探

沈大航, 乔文君, 刘 智, 童华荣, 陈应娟(西南大学,食品科学学院茶学系,食品科学与工程国家级实验教学示范中心,重庆 400715)

【研究意义】炭疽菌属(Colletotrichum)是子囊菌的一大类，种类复杂，一直以来对许多重要的农业经济和园艺作物均造成了严重危害，为害范围广，在植物病原真菌中占有非常重要的地位[1]，其中以C.gloeosporioides(有性型为Glomerellacingulata)[2-4]和C.acutatum(有性型为G.acutata)[5]最为常见。茶云纹叶枯病就是由Colletotrichum真菌引起的茶树叶部病害，是茶树的主要病害之一，在中国、日本、印度、斯里兰卡等茶树种植国均有相关报道，严重影响茶树的产量和茶叶品质[6-7]。为有效防治炭疽菌所引发的病害，必须对炭疽菌的进化与种类、生物学特性及致病机制有充分了解，才能有针对性地控制病害的发生。【前人研究进展】已报道的能侵染茶树叶片的炭疽菌属致病菌种类不多，有3个种的记录，分别为C.camelliae、C.crassipes和C.gloeosporioides[8]。近年来，随着分子诊断技术在植物病原菌鉴定中应用，越来越多新记录种不断被鉴定出来。刘威等[9]在福建茶树上发现并证实C.fructicola可侵染茶树并引发病症。王玉春等(2015)[10]采用系统发育学和形态学相结合的方法对中国 15 省(市、自治区)部分茶区茶树病叶进行病原菌鉴定，基本明确C.siamense为中国茶树病原菌。【本研究切入点】本实验室从重庆地区感病茶树叶片上分离到了多种炭疽菌，经形态学方法、rDNA-ITS序列比对以及致病性分析，其中1种被鉴定为C.acutatum，是茶树上的新致病种[11-12]，而C.gloeosporioides为重庆地区茶园的优势种。【拟解决的关键问题】本文对炭疽菌C.acutatum和C.gloeosporioides进行了生物学特性比较和毒素活性初探，以了解茶树炭疽菌的发生规律及致病机制，为茶树病害的有效防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试菌株来自2014-2015年从重庆永川、万盛、二圣镇等茶叶种植区采集的感病样本，经常规组织分离法和单孢分离法获得了纯培养菌，采用形态学鉴定和多基因遗传进化分析鉴定为C.acutatum和C.gloeosporioides，其中C.acutatum为茶树上的新致病种[11-12]。

1.2 方法

1.2.1 不同培养基对菌丝生长的影响 将在PDA培养基上培养5 d 的炭疽菌菌落用内径为5 mm打孔器打成菌块，分别接种在PDA(马铃薯葡萄糖培养基)、PSA(马铃薯蔗糖培养基)、OA(燕麦培养基)、TLA(茶树叶片浸汁培养基)和YMMA(霉菌培养基)5种培养基中，(25±2) ℃，12 h/d 光照培养7 d后用十字交叉法测量菌落直径并观察菌落形态，每个处理5个重复，实验结果重复3次。

PDA：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉20 g、水1000 mL；PSA：马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂粉20 g、水1000 mL；OA：燕麦片30 g、琼脂粉20 g、水1000 mL；TLA：茶树叶片20 g、琼脂粉20 g、水1000 mL；YMMA：蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、琼脂粉20 g、水1000 mL。

1.2.2 温度对菌丝生长的影响 把用内径为5 mm打孔器在活化后的炭疽菌菌落边缘打取菌丝块，接种到PDA平板中央，每个处理5次重复，分别放置于10、15、20、25、28、30、35、40 ℃培养箱下培养，7 d后用十字交叉法测量不同温度培养下菌落的生长直径。

1.2.3 菌丝致死温度测定 将用以上方法打取的菌丝块放入灭过菌的5 mL EP管中，加入4 mL无菌水，40、45、50、55、60、65 ℃恒温水浴中加热处理15 min，每处理5次重复。然后将菌块取出移至PDA平板培养基上，25 ℃培养7 d，观察各菌株菌落生长情况。

1.2.4 茶树炭疽菌毒素滤液的制备 将在PDA上培养5 d的供试菌株，采用直径5 mm的打孔器取菌饼圆片，然后将菌饼圆片接种于盛有50 mL Czapek-Dox培养液的三角瓶中，每个三角瓶接种5个菌饼后，放入25 ℃震荡培养箱中，每个处理各取振荡培养0、3、6、9、12和15 d的培养液。选用4层灭菌纱布过滤培养液，滤液在5000 r/min离心机中低速离心15 min，取上清，显微镜镜检无病原菌分生孢子和菌丝即获得病原菌毒素培养液，4 ℃保存备用。过滤出的菌丝在60 ℃烘箱中烘干，称量干重。

1.2.5 茶树炭疽菌毒素的毒性检测 参照张卫民(1995)[13]和刘守安等(2007)[14]的活体浸梢法进行茶树炭疽菌毒素的致病性检测。将制备好的茶树炭疽菌毒素滤液各取20 mL分别加入50 mL小烧杯中，以盛有等体积无菌水和纯培养液的处理为对照。取一芽三叶的福鼎大白茶树新梢，先用自来水冲洗干净，再用75 %乙醇处理30 s，无菌水冲洗3次后将其新梢基部浸入各烧杯中，每烧杯放入3枝茶树新梢，置于(25±2)℃恒温光照培养箱中进行培养，观察记录茶树新梢的感病状况，设置3次重复试验。茶树新梢感病状况分级标准见表1。

1.3 数据分析

采用IBM SPS 20.0软件进行数据统计分析，Turkey HSD进行差异显著性检验。

表1茶树炭疽菌毒素滤液对茶树新梢的伤害程度标准

Table 1 Standard for disease level ofColletotrichumspecies toxins on tea shoots

病情分级Disease level症状Symptom0级正常1级出现1^2个轻微坏死斑,叶片轻度萎蔫2级1/3叶片边缘坏死,叶片卷曲萎蔫3级1/2叶片边缘坏死,叶片卷曲萎蔫、失绿,其中1^2片叶坏死 4级叶片萎蔫至茶梢枯死

表2 不同培养基对茶炭疽菌生长的影响Table 2 Effect of various culture mediums on growth of Colletotrichum species

注：表中数据为平均值±标准差，同列数据后不同字母表示经Tukey HSD法检验P<0. 05 水平差异显著。

Note：Data are mean±SD．Different letters on the same column indicate significant difference atP<0. 05 level by Tukey HSD.

2 结果与分析

2.1 茶树炭疽菌的生物学特性

2.1.1 不同培养基对茶树炭疽菌菌落生长的影响C.gloeosporioides和C.acutatum在5种不同培养基上生长7 d后的培养结果表明，2种炭疽菌在不同培养基上的菌落生长情况比较相似，均能进行生长，总体上讲，C.gloeosporioides的生长速度快于C.acutatum。如表2所示，2种菌的菌落生长速度以及菌落形态因培养基不同差异显著，其中以在PDA和PSA上生长最好，且与在其他培养基上生长的菌落存在显著性差异，可视为是炭疽菌生长的最适培养基。其次是OA培养基，然后是YMMA培养基，而在TLA培养基上生长最差，2种菌的菌落大小仅分别为3.93和3.23 cm，且菌落疏松、菌丝少，不利于炭疽菌的生长。

2.1.2 温度对茶炭疽菌生长的影响 如图1所示，茶树2种炭疽菌在10～40 ℃的温度范围内培养7 d均能进行生长，10～25 ℃内，随温度的升高，菌落生长速度均显著加快，且C.gloeosporioides的生长较C.acutatum快；28 ℃时，C.gloeosporioides和C.acutatum的菌落生长速度均最快，在第7天时菌落直径可分别扩展到8.53和7.93 cm, 这与25 ℃时菌落生长速度差异并不显著，但与其它温度下培养的菌落直径存在显著性差异(P<0. 05)，因此认为25～28 ℃为2种茶树炭疽菌的最适生长温度；从28到40 ℃，2种炭疽菌的生长速度随温度的升高而急剧下降，到40 ℃时，菌落培养7 d仅扩展不到2 cm，但在较高温度下C.acutatum的生长快于C.gloeosporioides。

2.1.3 菌丝致死温度 如表3所示，经40～55 ℃水浴处理15 min后，2种茶炭疽菌C.gloeosporioides和C.acutatum菌块均能进行正常生长，以后随着温度的升高，菌块在60 ℃水浴处理后，C.gloeosporioides完全停止生长，而C.acutatum5个重复中尚有2个菌块能进行生长，65 ℃水浴处理后的菌块则能完全停止生长，说明C.gloeosporioides的菌丝致死温度为60 ℃，而C.acutatum的致死温度可以认为是60～65 ℃。

2.2 茶树炭疽菌毒素活性分析

本研究参考刘守安等(2007)[14]的方法比较了茶树炭疽菌在Czapek-Dox培养液、马铃薯葡萄糖培养液(PDB)和茶树叶片浸汁培养液中的菌丝生长情况，确定了最适合炭疽菌生长的培养液为Czapek-Dox培养液，并以Czapek-Dox培养液进行茶树炭疽菌的培养。采用茶枝活体浸梢法对2种炭疽菌C.gloeosporioides和C.acutatum的毒素活性进行初步分析，结果表明，在振荡培养3和6 d的2种炭疽菌毒素滤液中茶枝浸枝处理9 d后仍未观察到明显的毒素症状；在培养9 d的毒素滤液中则只观察到轻微的萎焉症状；在培养12和15 d的毒素滤液中症状出现最快，如表4所示，在培养15 d的C.gloeosporioides毒素滤液中，茶枝在浸枝处理3 d后最先出现轻微的局部组织坏死症状，受害等级参考表1描述为1级，随后坏死病斑逐渐扩大，叶片萎蔫、卷曲症状逐渐加重，直至枝梢干褐枯死，受害等级描述为4级，相比之下，C.acutatum毒素滤液处理的茶枝，症状稍弱，在浸枝处理4 d后才可见明显症状，12 d才能全部萎焉枯死。图2为在培养15 d的毒素滤液中茶枝浸枝6 d后的新梢症状，清水处理的茶枝仍能正常生长，C.gloeosporioides毒素滤液处理的茶枝叶片则出现坏死病斑及萎焉症状，而C.acutatum毒素滤液处理的茶枝症状较弱。以上结果表明，C.acutatum的毒素活性弱于C.gloeosporioides。

图中数据为平均值±标准差，同种菌数据上方的不同字母表示经Turkey HSD法检验P<0. 05 水平差异显著Data are mean±SD．Different letters on the same column indicate significant difference at P<0. 05 level by Tukey HSD图1 不同温度对茶炭疽菌生长的影响Fig.1 Effect of various temperature on growth of Colletotrichum species

表3 不同温度处理下茶炭疽菌菌落的生长情况Table 3 Growth of Colletotrichum species under different temperatures

注: +表示“生长”；-表示“不生长”。

Note：+ represents ‘growth’；- represents ‘no growth’.

表4 茶树炭疽菌毒素滤液对茶树新梢的伤害程度Table 4 Disease level of Colletotrichum species toxins on tea shoots

注：图中数值表示茶枝在振荡培养15 d后的茶树炭疽菌毒素滤液中浸梢处理0、3、6、9和12 d后的伤害情况。

Note：The data in Table 4 indicate the disease level ofColletotrichumspecies toxins cultured on culture media for 15 days on tea shoots at 0, 3, 6, 9 and 12 days.

A. CK(纯培养液处理);B. C. gloeosporioides毒素滤液处理的茶枝;C. C. acutatum毒素滤液处理的茶枝A. CK1 (tea shoots treated with culture media only); B. Tea shoots treated with C. gloeosporioides toxins; C. Tea shoots treated with C. acutatum toxins图2 茶树炭疽菌毒素处理茶树新梢后的症状Fig.2 Symptoms of tea shoots caused by Colletotrichum species toxins

3 讨 论

C.acutatumJ.H. Simmonds ex J.H. Simmonds是1965年由Simmond[15]所发现的能引起水果腐烂的病原菌，近年来随着分子标记技术和PCR诊断技术在植物病害鉴定中的应用，C.acutatum在各种寄主植物中被广泛报道，能侵染包括草本和木本农作物、观赏植物、水果以及松柏类植物在内的多种植物，并与C.gloeosporioides一起，被认为是世界内广泛存在的病原菌[16-20]。但一直以来未见有C.acutatum侵染茶树的报道，直到2015年在重庆采集的感病茶树叶片中分离到了该种炭疽菌[11]。C.gloeosporioides是茶树上一种常见炭疽菌种，在中国[7]、印度[6]等国茶树上均有相关报道，能侵染茶树导致茶树叶片出现坏死症状，严重时叶片萎焉脱落，影响茶树的产量及茶叶品质。为有效地了解此病害的发生规律，本研究对此2种炭疽菌的生物学特性进行了进一步分析，结果表明C.gloeosporioides和C.acutatum该2种炭疽菌均最适宜在PDA和PSA培养基中进行培养，而生长的适宜温度均在25～28 ℃之间，高温和低温均不利于菌落生长，但菌在40 ℃时仍能进行生长，菌丝致死温度则在60～65 ℃之间，这可能与重庆地区茶云纹叶枯病发病高峰期夏秋季的气温偏高有关，了解病原菌的生物学特性对探讨病害的发生规律及原因具有重要意义。

4 结 论

植物病原真菌分泌的致病外毒素是病程相关的一类重要致病因子，能使寄主植物出现特定病症反应，在植物病害的发生、发展过程中具有明显的致病作用[21]。现已发现的植物产毒真菌种类较多，研究表明炭疽菌(Colletotrichum)能够产生强致病性毒素，且在较低浓度下可诱发植物产生病状[22-27]。现有关茶树病害中毒素物质的研究在国内仅有少量报道，只有少数关于茶炭疽病菌(Gloeosporiumtheae-sinensisMiyake)以及茶轮斑病菌(Pestalotiopsistheae)毒素物质的研究报道，尚未见有茶树不同炭疽菌种C.gloeosporioides和C.acutatum的毒素活性的研究报道。本研究通过茶枝活体浸梢法初步证实了这2种炭疽菌的产毒活性，为后续茶树炭疽菌的致病性差异及其致病机制研究奠定了基础，也为炭疽菌的的有效防治开辟了新的路径。

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