复方当归注射液对拟缺血损伤大鼠脑微血管内皮细胞的影响

，， ， ，淑艳，

缺血性中风，亦称脑卒中，是以脑部缺血损伤为主要临床表现的疾病，具有较高的发病率、死亡率[1]，由血管栓塞引起的死亡率约占每年总死亡率的9%[2]，对病人的心理和生理造成巨大威胁。缺血性中风具有复杂的发病机制，涉及氧化应激、炎症反应、细胞凋亡等病理机制。因此，研究缺血性中风的发生、发展机制，积极开展有效的早期预防和病人的临床用药观察，对提高病人生活质量，降低病死率、致残率具有重要意义。

缺血脑组织可产生许多氧自由基，超出身体对氧自由基的清除能力。已有研究证实，缺血性中风后活性氧自由基引起缺血性脑损伤，诱发多种生物大分子如蛋白质、核酸结构和功能改变，引起受损的细胞膜发生脂质过氧化反应，生成脂质过氧化物丙二醛(malondialdehyde，MDA)，对机体造成不可逆损伤[3-4]。活性氧自由基通过生物分子的修饰作用导致或加重炎症反应发生，之后二者相互作用影响神经细胞功能[5]。

脑微血管内皮细胞(BMECs)是血脑屏障最早受到缺血缺氧损伤的细胞，也是血脑屏障的关键细胞[6]，因此寻找有效对抗其发生炎症反应和氧化损伤的机制，可改善缺血缺氧引起的脑损伤提供有效的治疗措施。复方当归注射液(compound angelica injection，CAI)是临床应用多年的中药注射剂，其组方由当归、川芎、红花3味中草药组成，具有行气活血、化瘀止痛功效，常用于治疗痛经、闭经、风湿痹痛及中风后遗症等[7]。临床研究发现，运用CAI干预治疗急性脑梗死，病人血清维生素B12水平明显高于对照组，具有较好的疗效，可改善急性脑梗死病人神经功能[8]。本课题组前期实验已发现，CAI可明显改善缺血性脑损伤，促进神经功能恢复[9]。本研究从离体角度观察CAI对缺血性脑损伤的干预作用，采用氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation，OGD)方法制备BMECs拟缺血损伤模型，通过CAI干预，检测脑损伤相关的炎症因子及氧化损伤指标。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性清洁级SD大鼠幼鼠9只，体重20 g±5 g，购于北京斯贝福实验动物公司，许可证号：SCXK(京)2011-0004。

1.2 实验药品与主要试剂 CAI购自福建古田药业有限公司，生产批号1506033；DMEM/F-12培养基干粉购自美国Gibco公司；明胶、胰蛋白酶、EDTA、胶原酶均购自美国Sigma公司；胎牛血清、培养瓶、离心管购自美国Corning公司；胰岛素注射液购自江苏万邦生化医药股份有限公司，生产批号4349503；肝素注射液购自常州千红生化制药股份有限公司，生产批号1516110294；ECGS购自北京中科迈晨科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司。丙二醛(MDA)检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin 6，IL-6)试剂盒，均购自武汉六合生物技术有限公司。

1.3 主要仪器 二氧化碳恒温培养箱、超净工作台、SHKE4000-8CE，Thermo Scientific公司生产；倒置相差显微镜，日本Olympus公司生产；台式低速离心机，德国Eppendor公司生产；立式压力蒸汽灭菌器、电热恒温鼓风干燥箱，上海博迅实验有限公司医疗设备厂生产；酶标仪，美国BIO-RAD公司生产。

1.4 BMECs的原代培养与传代 参考朱元等[10]研究方法进行原代BMECs培养。无菌条件下剥离大脑得到大脑皮质，匀浆过滤得到大脑微血管段，消化冲洗后加入BMECs完全培养液制成细胞悬液，接种于培养瓶，根据细胞生长情况进行换液和传代。

1.5 分组、拟缺血处理与样品收集 将培养至第3代的BMECs分为正常组、模型组和CAI组。待细胞汇合至70%～80%，CAI组更换培养液为完全培养液配制的含药培养液，继续培养12 h。造模开始前将正常组培养液更换为DMEM-F12培养液，模型组培养液更换为Kerb’s液，CAI组培养液更换为Kerb’s液配制的含药培养液(1 μL/mL CAI无血清)，通过OGD方法拟缺血造模6 h。造模结束后，使用胰蛋白酶消化并收集细胞，并加入一定量的生理盐水，在超声细胞破碎仪中进行低温破碎，离心并收集上清，置于-80 ℃备用。

1.6 炎症反应与氧化损伤指标检测 根据BCA蛋白检测试剂盒进行蛋白含量测定。根据IL-6和TNF-α试剂盒进行酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测，反应终止后立即在酶标仪中进行双波长450 nm和630 nm吸光值检测。采用硫代巴比妥酸法检测MDA含量。

2 结 果

2.1 3组MDA含量比较 经过OGD法造模，与正常组比较，模型组BMECs中MDA含量显著升高(P<0.05)，说明拟缺血损伤可加重BMECs氧化损伤；与模型组比较，CAI组MDA含量明显降低(P<0.05)。详见表1。

μmol/mL

2.2 3组TNF-α与IL-6表达水平比较 OGD法造模后，与正常组比较，模型组BMECs中TNF-α及IL-6表达水平显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)，说明OGD可增加炎症因子的表达。与模型组比较，CAI组TNF-α、IL-6表达水平显著降低(P<0.05)。详见表2。

组别nTNF-αIL-6正常组30.075 0±0.009 70.024 6±0.000 5模型组3 0.443 3±0.053 71) 0.053 7±0.007 31)CAI组3 0.220 3±0.047 32) 0.028 7±0.007 52) 与正常组比较,1)P<0.05;与模型组比较,2)P<0.05。

3 讨 论

炎症伴随多种疾病过程的病理反应，参与多种疾病的发生发展。现代研究已证实，缺血缺氧可引起具有免疫活性的细胞产生大量炎症因子，TNF-α为炎症反应中的关键因子，IL-6是一种免疫调节因子，在缺血性脑损伤中均有参与，启动多种病理过程发生对细胞的炎症损害[11]。TNF-α和IL-6具有诱导炎症介质分泌及激活中性粒细胞发生趋化性等相关作用，生成氧化产物和诱导细胞内酶发生神经毒性反应，对大脑造成再次损害[12]。有研究发现，TNF-α和IL-6等炎症因子水平增高与脑卒中的发生及严重程度密切相关[13]。因此，研究炎症因子在缺血性脑损伤中的作用，可对缺血性中风防治提供重要的应用价值。结扎大鼠双侧颈总动脉引起的缺血再灌注损伤实验，CAI可降低缺血区IL-6含量，发挥抗炎作用[14]。

氧化损伤是机体受到某种刺激时氧化-还原的平衡状态受到破坏，产生并积累大量自由基，引起机体细胞与组织结构功能受损的病理过程。由于大脑组织含有丰富的脂质，当机体发生缺氧损害时，细胞可产生大量氧自由基，细胞膜首先发生脂质过氧化反应，引起细胞通透性改变，导致细胞发生代谢障碍，最终引起细胞凋亡，因此大脑对活性氧自由基敏感[15]。MDA是脂质过氧化反应的终产物，其含量可间接反映机体组织脂质过氧化程度[16]。采用H2O2制备心肌细胞凋亡引起的损伤模型中，CAI干预后可抑制细胞内的氧自由基，降低细胞内的乳酸脱氢酶和MDA含量，提高细胞抗氧自由基的能力[17]。

本课题组前期研究已证实，CAI对局灶性脑缺血损伤有较好效果，可减小脑梗死体积，显著改善神经功能。本实验研究结果显示，CAI可明显抑制拟缺血损伤引起的炎症因子TNF-α和IL-6含量增加，并且改善拟缺血引起的氧化损伤，显著下调MDA含量，表现抗炎的作用和增加BMECs的抗脂质过氧化能力。通过检测上述指标可间接反映缺氧对大脑损伤的程度，为CAI改善缺血引起的炎症反应和氧化损伤提供数据支持。

综上所述，本实验在细胞水平上通过OGD法对BMECs造成拟缺血损伤，探讨CAI对拟缺血损伤BMECs的影响。结果证实CAI对拟缺血损伤BMECs有明显的抗炎和抗脂质过氧化作用，进而维持大脑内环境的稳定，但CAI保护拟缺血BMECs的具体作用机制需进一步研究探讨。

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