植物类物证DNA遗传标记鉴定系统的建立

李 辉 ，夏 攀 ，王 创 ，汪 远 ，赵雪莹 ，马 克 ，戴 维 ，曹 禹 ，周怀谷 ，刘文斌

（1.法医物证学现场应用技术公安部重点实验室 上海市现场物证重点实验室 上海市刑事科学技术研究院，上海 200083；2.浙江大学植物生理学及生物化学国家重点实验室，浙江 杭州 310058；3.中国科学院上海辰山植物科学研究中心，上海 201602）

在各类犯罪案件现场的勘验过程中，除了人体来源的检材物证外，还可能获得与犯罪相关的各种植物类物证。对植物类物证进行来源和种属的鉴定，往往能够为案件侦破提供线索和证据[1]。但是，目前对植物类物证鉴定主要依赖形态学方法，一方面对鉴定人员的经验和专业要求较高，另一方面，受制于现场实际情况，植物类物证通常已经破碎、发霉、腐败或者缺乏分类学特征，因此，传统方法在实际办案中面临较大的困难[2]。

随着分子生物学的发展，通过DNA鉴定有望使植物类物证的鉴定摆脱形态学方法鉴定的局限。根据一段或者几段DNA标记序列，即DNA条形码（DNA barcode），来分析鉴定物种，是目前生物鉴定的最新方向[3]。目前在国内外植物分类学研究[3-9]中，有十多个DNA片段以及片段组合被提出作为标记进行植物种属的分析。本研究中，我们选择了三个基因片段（rbcL、matK、ITS）作为标记，尝试建立一套针对植物类物证的DNA遗传标记鉴定系统，通过对200例已明确种属特性植物的鉴定结果评估该鉴定系统的通用性和识别能力。

1 材料与方法

1.1 植物样本采集

在辰山植物园植物分类学专家的指导下，收集上海地区各类常见植物（以野生植物为主，辅以部分引进品种和景观植物），并根据形态学特点确认物种，共200种（171个属，80科），每种植物采集叶片部分。

1.2 主要试剂和仪器

DNeasy®Plant Mini试剂盒（德国QIAGEN公司），琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒［DP209，天根生化科技（北京）有限公司］，BigDyeTMTerminator v3.1 Cycle Sequencing试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

NanoDropTM2000分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司），DYCP-32B型琼脂糖水平电泳仪（北京六一生物科技有限公司），9700型PCR仪（美国AB公司），3500xL基因分析仪（美国AB公司），ChemiDOC MP凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。

1.3 植物DNA提取及定量

每个植物样本取20～100mg，经液氮冷冻处理后，研磨成粉末状，按DNeasy®Plant Mini试剂盒使用说明书提取植物DNA，并使用NanoDropTM2000分光光度计定量后备用。

1.4 PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳

PCR 扩增体系包括：DNA 模板 1μL，2×Taq PCR反应混合物 15 μL，正向引物 1.25 μL，反向引物1.25 μL，ddH2O 补至 30 μL。 在 9700型 PCR 仪上进行扩增，PCR 反应条件：95℃ 5 min；94℃ 20 s，56℃20s，72℃ 40s，32 个循环；72℃ 10min。根据文献[4-5，10]报道筛选出3对通用引物，由美国Thermo Fisher Scientific公司合成序列（表1）。PCR产物用1.2%凝胶在DYCP-32B型琼脂糖水平电泳仪上进行电泳，由ChemiDOC MP凝胶成像系统分析。

表1 DNA标记的通用引物序列

1.5 产物回收及测序

根据产品说明，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对有条带的PCR产物进行纯化。并使用BigDyeTMTerminator v3.1 Cycle Sequencing试剂盒将纯化回收的DNA在3500xL基因分析仪上进行直接测序，测序引物即为扩增引物，对每个产物都采用双向测序，取重叠部分序列作为测序结果。

1.6 美国国立生物技术信息中心数据库比对

将测序结果使用美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的BLAST进行比对，记录BLAST结果中匹配度和覆盖度较高的物种信息，并进行分析，根据测序序列可能对应的物种，并结合样本已确认物种名，将比对结果记录为科、科偏属、科偏种（某些单种属植物）、属、属偏种、种、比中其他科物种，BLAST比对结果普遍匹配度和覆盖度都低的记录为未比中，说明NCBI数据库中没有该物种基因序列的记录。将测序序列输入NCBI数据库进行比对的结果一般根据BLAST评分从高到低排列，其参考依据主要是序列的匹配度和覆盖度。对于某些同一科植物，可能在单个片段序列上相似，但该科下的某个属植物的BLAST评分略高于该科下的其他属，但是差异仅为十几个甚至几个碱基，不能排除其为其他属的可能性，故表述为“科偏属”，“属偏种”同理；而“科偏种”的表述主要是指某些属只有一个物种，而又与同科其他属比较相近的情况。

2 结 果

2.1 植物DNA提取及定量

利用DNeasy®Plant Mini试剂盒提取后所得DNA的量不同，NanoDropTM2000分光光度计定量后质量浓度范围为 4.0～58.9ng/μL。

2.2 PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳

绝大多数植物样本在rbcL、matK、ITS三个片段的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳都能得到明亮的单一条带（图1）。其中，rbcL扩增成功199种，成功率为99.5%；matK扩增成功185种，成功率为92.5%；ITS扩增成功200种，成功率为100%。

图1 部分植物琼脂糖凝胶电泳结果

2.3 DNA测序及NCBI数据库比对

所有PCR扩增产物经纯化后双向测序，通过NCBI数据库BLAST比对，结果见表2。另外，在ITS片段的扩增产物中，有16例样本扩增产物比对到真菌及12例样本扩增产物的测序结果呈双峰无法进行BLAST比对，所以ITS实际的有效扩增成功率为86.0%（172/200）。

表2 不同DNA标记鉴定能力统计 （例）

3 讨 论

法医植物学是法庭科学中有待开发的领域[11]，植物类物证的DNA遗传标记鉴定是近年来法医植物学研究的主要方向[12]。利用DNA标记鉴定物种在各个领域中都有着广泛的前景。在动物中，利用线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ（cytochrome c oxidase subunitⅠ，COⅠ）基因作为标记进行鉴定，成功率达到95%以上[13]，已经成为国际通用的物种鉴定技术，广泛应用于法医、海关和加工食品等的鉴定。在本研究中，我们建立了一套包含多个DNA标记片段的植物类物证鉴定系统，并通过大量不同物种的植物样本来评价其鉴定的识别能力。选择的三个作为鉴定标记的基因片段中，rbcL和matK是第三届国际DNA条形码会议上被推荐作为植物DNA标准条形码的核心标记[6]，而ITS是中国植物条形码协会进一步建议的补充标记[7]。

从琼脂糖凝胶电泳的结果来看，绝大多数植物样本都能得到明亮的单一条带，其中rbcL和matK的扩增产物经纯化后都能得到理想的测序序列，rbcL引物的通用性略高于matK，而ITS虽然得到了100%（200/200）的明亮的单一条带，但经过测序后发现12个样本测序结果呈双峰，无法进行BLAST比对，另外16个样本扩增产物比对到真菌，所以ITS实际的检测成功率为86.0%（172/200）。因此，三个片段标记的检测成功率为rbcL〉matK〉ITS，三个标记的引物总体都具有较好的通用性。而关于ITS产物检测出真菌的问题，分析认为，不同于叶绿体基因片段rbcL和matK，ITS是核基因片段，是真核生物rDNA中5.8S rDNA和28S rDNA基因间隔序列，这段序列植物与真菌都拥有，如果在样本DNA提取过程中混入了植物上附带的真菌DNA，当样本植物的DNA量相对较低时，PCR扩增过程中真菌序列占据上风，被大量复制，BLAST比对出真菌序列。此外，扩增产物受真菌影响测序结果呈双峰时，则无法进行比对。

从测序序列在NCBI数据库的BLAST比对结果来看，rbcL的识别能力大多数情况下只能达到属水平，与之前的研究一致，KRESS等[8]认为rbcL的变异只存在于种以上的分类水平，在单个物种水平上变异不大，因此只适合作为属水平或者以上的分类。matK的识别能力优于rbcL，但引物通用性不如rbcL[9]。综上所述，以rbcL+matK作为组合优于单rbcL或者单matK的识别能力，仍然不足以达到物种水平，其识别能力主要集中在属及属以上水平。ITS作为植物DNA鉴定标记的潜力在近年来的研究中已逐步得到了认可[13]。但是鉴于ITS检测结果的不稳定性，不适合作为单标记进行鉴定，可作为rbcL+matK组合的有力补充，在本研究中，当以rbcL+matK+ITS组合进行鉴定时，识别能力明显提高（表2），对大部分样本能够达到属及属以下水平。

当不同标记片段比对结果出现矛盾时，需要进一步综合分析，必要时加入新的片段进行补充鉴定。如126号植物rbcL和matK的比对结果不同，rbcL比对到牡荆属，而matK比对到悬钩子属，最后根据ITS的比对结果，认定为牡荆属并且倾向于牡荆物种，与形态学上认定的结果一致。此外，同一物种在NCBI数据库中可能比对到多条匹配度和覆盖度相似的记录，需要鉴定人员结合各个标记的比对结果，综合判断。对于某些科的植物，如蔷薇科、菊科，rbcL、matK和ITS三个标记片段序列都十分相似，rbcL+matK组合往往只能认定到科水平，加上ITS也只能认定到属，在今后的研究中可能需要加入新的标记片段来提高识别能力。综合目前国内外相关报道以及本研究的内容，仅依靠单个DNA标记片段来鉴别植物的种属是十分困难的，但是通过几个基因片段的组合，达到植物种属乃至物种的鉴定是可行和有效的[14]。

利用DNA遗传标记对植物种属进行鉴定的方法在农业、植物学以及生物分类学等多个领域已经得到广泛的应用，而在法庭科学领域中，应用于植物类物证的鉴定工作尚处于探索阶段。本研究通过对上海地区200例常见植物的DNA提取、扩增和测序，初步建立了一套以rbcL、matK和ITS三个基因片段作为标记的植物类物证物种鉴定系统，该系统具有良好的通用性，对于大部分植物样本的识别能力能够达到属及属以下水平。笔者认为，对于特定地区的植物类群构建DNA数据库，有利于办案人员能够快速完成植物类物证物种的鉴定，降低鉴定物种所需的人力和资金成本，使植物种属鉴定在刑事科学技术以及法庭科学领域中发挥作用。

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