七氟醚联合氧化亚氮吸入麻醉致脑功能下降与CREB信号通路的关系

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[1.陆军军医大学(第三军医大学)第二附属医院急诊科，重庆 400037；2.陆军军医大学(第三军医大学)第二附属医院麻醉科，重庆 400037；3.陆军军医大学(第三军医大学)第二附属医院呼吸科，重庆 400037]

学习和记忆属于高等动物脑功能的一部分，研究表明麻醉患者脑功能损害时有发生，主要表现在空间记忆以及学习能力的下降[1]，但对不同人群不同麻醉方式产生效应的研究却较为有限，对分子机制的认识也较为局限。既往研究表明环腺苷酸应答元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)磷酸化与神经元的数量、功能、再生、凋亡密切相关[2]，而记忆学习又受海马区神经元直接相调控，所以CREB或直接影响着学习和记忆的功能[3-5]。有文献报道环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)对细胞代谢的调节十分广泛，其反应蛋白CREB参与多条细胞代谢过程[6]，然而CREB是否参与吸入麻醉所致的脑功能损害尚不明确。本研究通过临床试验和动物实验比较七氟醚联合氧化亚氮吸入麻醉后对CREB表达及空间学习记忆运动影响，探讨脑功能致损的潜在机制，同时对不同麻醉方式、不同麻醉人群以及麻醉时长做了初步研究，为七氟醚联合氧化亚氮吸入麻醉致脑功能下降提供可能的防治策略。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择我院急诊科2014年1月至2017年4月收治的442例患者，按照麻醉方式的不同分为3组。吸入麻醉组118例采用七氟醚联合氧化亚氮麻醉，其中男60例，女58例，年龄17～78岁，平均(42.2±9.8)岁；体质量(62.3±15.2)kg，身高(167.4±8.8)cm。局部麻醉组206例采用普鲁卡因麻醉，其中男101例，女105例，年龄22～76岁，平均(43.4±6.9)岁，体质量(57±9)kg，身高(162.5±4.8)cm。对照组118例不做麻醉处理，其中男64例，女54例，年龄19～77岁，平均(44.2±6.8)岁，体质量(67.3±13.4)kg，身高(169.4±9.1)cm。所有患者心肺功能良好，肝肾功能及电解质等各项检查均提示耐受麻醉及手术，排除重要脏器功能障碍、精神异常、感觉存在障碍、智力低下者。3组患者比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 实验动物

实验大鼠购于第三军医大学动物实验中心，使用许可证号为SYXK(渝)2012-0002，动物实验通过实验动物管理委员会批准并在第三军医大学动物实验中心完成。大鼠饲养置于SPF级动物房，室温25 ℃，湿度60%，食物灭菌。

1.3 实验试剂

兔抗鼠cAMP、CREB、pCREB单抗、β-actin抗体(内参)以及ELISA Kit酶联免疫试剂盒购自美国Santa Cruz biotechnology公司，生物素化抗兔IgG抗体，购自北京方盛公司，蛋白浓度测定试剂盒、组织蛋白抽提试剂盒、BCA显色试剂盒购自Beyotime上海分公司，PVDF膜购自德国MC公司，蛋白上样缓冲SDS-PAGE液凝胶配制试剂盒、化学发光试剂盒、苯甲基磺酰氟(PMSF)均购自碧云天生物技术公司。

1.4 ELISA 法检查血液标本中cAMP表达情况

静脉穿刺获取入组人员外周血5 mL于抗凝管内，4 ℃保存，按Innogenetics公司生物诊断试剂人cAMP ELISA试剂盒说明书操作，450 nm读取结果，Lowry法计算目的蛋白含量。

1.5 Morris 水迷宫实验

所有动物实验操作均遵守第三军医大学动物管理委员会关于动物实验的相关规定。60只5月龄大鼠随机分为麻醉组(n=30)和对照组(n=30)。麻醉组大鼠持续吸入1.3%七氟醚联合50%氧化亚氮4 h，对照组吸入50%氧气4 h，流量3 L/min。麻醉过程保留自主呼吸。大鼠Morris水迷宫主要设备包括：①1个装有水的圆形水池，其直径100 cm、高50 cm，水深25 cm，水温(26.0±1.0)℃；②隐藏在水面下1 cm的透明平台(平台所在象限定义为四象限)；③1套图像自动采集和处理系统。水迷宫训练过程包括定位航行实验和空间探索。开始3 d让大鼠适应周围环境，每天将大鼠面向池壁随机从4个象限放入水中4次，通过摄像系统自动记录并应用相应软件分析其游泳轨迹，大鼠寻找平台的最大时限设定为2 min，登台5 s视为成功找到隐蔽平台，摄像系统自动停止记录。平台停留1 min，以提供时间让大鼠观察周围提示物，然后开始下一次训练。保证所有大鼠的训练间隔时间一致。如大鼠在1 min内未找到隐蔽平台，摄像系统自动停止记录，逃避潜伏期(自入水至寻找到隐蔽平台的时间)记为1 min。空间探索实验分别在第3天、1个月、3个月进行去除平台，然后任选2个入水点将大鼠放入水池中，记录其在1 min内的游泳轨迹。取2次的平均值作为空间探索实验的结果。根据系统自动分析的结果，在空间探索实验中平台象限游泳距离占总距离百分比大于30%，认为大鼠对提示物和平台空间位置关系形成记忆。

1.6 Western blot检测cAMP、CREB、pCREB蛋白的表达

大鼠断头取脑，并研磨之后，充分裂解，BCA法测定蛋白浓度及蛋白变性。选用BCA试剂盒，计算待测蛋白的浓度。计算浓度后充分变性，低温冰箱保存，根据检测出的蛋白浓度，配平各蛋白，蛋白电泳，转膜孵育一抗以及二抗。之后根据BCA说明书加入适量的发光液，进行曝光并采集图像，采用Quantity One软件进行灰度值分析，目的蛋白相对表达水平则通过目的蛋白的灰度值除以内参蛋白(本实验内参采用β-actin)的灰度值的比值表示。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 吸入麻醉组麻醉前与麻醉后血液中cAMP浓度比较以及MMSE评分情况

吸入麻醉组患者麻醉前与麻醉后比较，麻醉后血液中cAMP浓度下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；麻醉后定向力、记忆力、语言能力MMSE评分下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；计算能力评分变化差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1吸入麻醉组患者麻醉前后血液中cAMP浓度及MMSE评分(n=118)

时间 cAMP浓度(μg/ mL)MMSE评分(分)定向力记忆力语言能力计算能力麻醉前0.71±0.158.21±0.953.21±1.157.04±0.854.21±1.35麻醉后0.54±0.187.15±0.962.11±0.755.21±0.974.17±1.22t 7.8818.5258.70315.4130.238P 0.0410.0370.0360.0200.425

2.2 各组患者麻醉后cAMP浓度比较以及MMSE评分情况

吸入麻醉组麻醉后血液中cAMP浓度较局部麻醉组和对照组比较均下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，且麻醉后定向力、记忆力、语言能力MMSE评分下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，计算能力评分变化差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.3 吸入麻醉患者中高龄组与低龄组cAMP浓度变化比较以及MMSE评分变化情况

高龄组患者(>50岁)72例与低龄组(<50岁)46例比较，高龄组液中cAMP浓度变化更大，差异具有统计学意义(P<0.05)；麻醉后定向力、记忆力、语言能力MMSE评分变化更大，差异具有统计学意义(P<0.05)，计算能力评分变化差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

2.4 吸入麻醉患者中长时间麻醉组与短时间麻醉组cAMP浓度以及MMSE评分变化情况

麻醉长时间组(>2 h)68例与短时间组(<2 h)50例比较，长时间组中cAMP浓度变化更大，差异具有统计学意义(P<0.05)；麻醉后定向力、记忆力、语言能力MMSE评分变化更大，差异具有统计学意义(P<0.05)，计算能力评分变化差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

2.5 水迷宫实验

在定位航行实验中，麻醉组大鼠找到平台的潜伏期比对照组找到平台时间(平台潜伏期)长，麻醉组穿越平台的次数比对照组大鼠少，麻醉组大鼠2 min内在水迷宫中的运动距离比对照组大鼠少，2组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，且麻醉组各项指标变化呈时间相关性(表5～7)。

表2 各组患者cAMP浓度及MMSE评分

*:与局部麻醉组比较，P<0.05；#：与对照组比较，P<0.05

表4 吸入麻醉患者中长时间组与短时间组cAMP浓度变化及MMSE评分变化

组别 平台潜伏期(min)越平台的次数(次)运动距离(cm)麻醉组68.01±7.899.03±1.821 351.68±141.81对照组32.21±5.2516.61±3.511 751.03±181.49t 20.69010.5009.497P 0.0150.0300.034

组别 平台潜伏期(min)越平台的次数(次)运动距离(cm)麻醉组78.01±9.198.03±1.371 157.68±181.51对照组29.21±4.5118.91±2.111 651.03±201.87t 26.11011.4789.954P 0.0120.0260.031

组别 平台潜伏期(min)越平台的次数(次)运动距离(cm)麻醉组87.51±8.156.21±1.54911.51±151.82对照组30.21±5.5817.65±2.911 798.03±191.53t 30.84011.98719.866P 0.0100.0260.016

2.6 Western blot检测cAMP、pCREB、CREB蛋白相对表达水平

Western blot检测结果显示，麻醉组大鼠cAMP、pCREB蛋白相对表达水平均低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，2组大鼠CREB蛋白相对表达水平差异无统计学意义(P>0.05)(图1、图2)。

β-actin为内参对照

*：与麻醉组比较，P<0.05

3 讨论

术后认知功能障碍是麻醉后一种常见的并发症，但其发生与麻醉方式、计量、时间的关系并不十分明确，其发病机制也有待进一步研究。神经细胞凋亡、半胱天冬酶的激活、神经变性、Aβ的沉积、cAMP-CREB-AKT通路的抑制都与阿尔兹海默症的发生相关，都参与了脑功能的调节[7]，其中CREB是细胞核内的转录因子蛋白的重要成员，参与了cAMP-CREB-AKT偶联信号通路的激活，通过对ser133位点磷酸化的调控使其发挥调控作用，增强了神经元钠/钾-ATP泵的活性，达到增强神经元兴奋性，提高学习记忆能力[8]，此外该通路还能促进神经元间突触联系形成，增加特异性突触偶联加强中枢神经系统的传导、储存。有研究表明抑制CREB表达，对大鼠长期记忆起到显著抑制作用，但短期记忆仍相对完整[9-10]，这是因为磷酸化CREB (p-CREB)能在mRNA调控下，转录并编码蛋白，其中一部分对维持学习和长期记忆有明显作用[11]。本研究发现吸入麻醉组患者麻醉后血液中cAMP浓度下降、定向力、记忆力、语言能力MMSE评分下降且差异显著，计算能力评分差异不显著，这就证实七氟醚、氧化亚氮等吸入性麻醉药物确实能降低体内cAMP浓度，并直接影响定向力、记忆力、语言能力，也就是说麻醉药物可能导致了体内cAMP浓度改变，cAMP-CREB-AKT偶联信号通路可能参与到了脑功能的调控。同时，吸入麻醉组血液中cAMP浓度较另两组下降、麻醉后定向力、记忆力、语言能力MMSE评分下降且差异显著，由此可见七氟醚、氧化亚氮等吸入性麻醉药物可能是下调cAMP的关键因素，其效果较其他麻醉方式更显著，且患者年龄越大，麻醉时间越长，cAMP的下降及脑功能损害也越严重。动物实验发现麻醉组大鼠找到平台的潜伏期比对照组找到平台时间长，穿越平台的次数及运动距离却比对照组少且麻醉组各项指标变化呈时间相关性，提示吸入麻醉所致的脑功能损害随时间推移损害加重。Western blot检测结果显示麻醉组cAMP、pCERB蛋白相对表达水平均低于对照组，这可能与CAMP/CREB信号通路减弱，导致pCREB促进新生神经细胞的增殖与发育成熟的过程相关[12-13]。综上所述七氟醚联合氧化亚氮急诊吸入麻醉致脑功能下降与受麻醉者的年龄以及接受麻醉时间相关，而致脑功能下降的原因可能是增加了核内第二信使CAMP的水解，从而导致其介导的CREB蛋白发生磷酸化水平降低。故在临床治疗过程中，对于不同的受麻醉群体，应当尽量选择更合理的麻醉方式，尤其老年患者应尽量缩短其麻醉时间[14]。而麻醉后脑功能障碍是否能通过人为对cAMP-CREB-AKT偶联信号通路的干预而发生逆转也是值得研究的方向。

[参考文献]

[1] Zhou Q,Zhou P,Wang AL,et al.The primed SNARE-complexin-synaptotagmin complex for neuronal exocytosis[J].Nature,2015,525(7567):62.doi.10.1038/nature23484.

[2] Y Tang,X Yu,B Zhou,D Lei,et al.Short-term cognitive changes after surgery in patients with unilateral mesial temporal lobe epilepsy associated with hippocampal sclerosis[J].J Clin Neurosci,2014,21(8):1413-1418.doi:10.1016/j.jocn.2013.12.018.

[3] Brightwell JJ,Smith CA,Neve RL,et al.Long-term memory for place learning is facilitated by expression of camp response element-binding protein in the dorsal hippocampus[J].Learn Mem,2007,14(3):195-199.doi.10.1101/lm.395407.

[4] Li YF,Huang Y,Amsdell SL,et al.Antidepressant and anxiolytic-like effects of the phosphodiesterase-4 inhibitor rolipram on behavior depend on cyclic amp response element binding protein-mediated neurogenesis in the hippocampus[J].Neuropsychopharmacology,2009,34(11):2404-2419.doi:10.1038/npp.2009.66.

[5] Otmakhov N,Khibnik L,Otmakhova N,et al.Forskolin-induced Itp in the cal hippocampal region is nmda receptor dependent[J].Neurophysiol,2004,91(5):1955-1962.doi:10.1152/jn.00941.2003.

[6] Lonze BE,Riccio A,Cohen S,et al.Apoptosis,axonal growth defects,and degeneration of peripheral neurons in mice lacking creb[J].Neuron,2002,34(3):371-385.doi:10.1016/S0896-6273(02)00686-4.

[7] Vlisides P,Xie Z.Neurotoxicity of general anesthetics:an update[J].Curr Pharm Des,2012,18(38):6232 -6240.doi:10.2174/138161212803832344.

[8] Guo J,Wang H,Wang Q,et al.Expression of pCREBand activity dependent miR132 in temporal lobe epilepsy[J].Int J Clin Exp Med,2014,7(5):1297-1306.

[9] Carlezon WA Jr,Duman RS,Nestler EJ.The many faces of creb[J].Neurosci,2005,28(8):436-445.

[10] Brightwell JJ,Smith CA,Countryman RA,et al.Hippocampal overexpression of mutant creb blocks loner term,but not short-term memory for a socially transmitted food preference[J].Learn Mem,2005,12(1):12-17.doi:10.1101/lm.85005.

[11] Fujioka T,Fujioka A,Duman RS.Activation of maturation of newborn neurons in adult hippocampus camp signaling facilitates the morphological[J].Neurosci,2004,24(2):319-328.doi:10.1523/JNEUROSCI.1065.03.2004.

[12] Dong Y,Wu X,Zhang G,et al.Isofluranefacilitates synaptic NMDA receptor endocytosis in mice primary neurons[J].Curr Mol Med,2013,13(4):488-498.doi:10.2174/1566524011313040003.

[13] Liu J,Wang P,Zhang X,et al.Effects of different concentration and duration time of isoflurane on acute and long-term neurocognitve function of young adult C57BL/6 mouse[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(9):5828-5836.

[14] 张 英,陈 杰,文欣荣,等.2种麻醉方式对老年腔隙性梗死患者术后知期认识功能的影响[J].局解手术学杂志,2016,25(11):841-843.doi:10.11659/jjssx.06E016017.