慢性间歇性低氧对麻醉大鼠心血管系统的影响

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(四川省医学科学院,四川省人民医院麻醉科，四川 成都 610072)

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(obstructive sleepapnea syndrome，OSAS)是一种临床上常见的疾病，在中老年人群的患病率为4%左右。冠心病、高血压、充血性心力衰竭等多种心脏疾病是OSAS的重要危险因素[1-3]。现有的睡眠呼吸暂停的基础及临床研究发现，夜间反复的低氧复氧可导致交感神经驱动增加、氧化应激和炎症反应的发生，诱导了心血管系统的损害[4]，但是睡眠呼吸暂停患者心功能异常的相关机制还不是很明确。OSAS致器官损伤的一个重要机制是慢性间歇低氧(chronicintermittent hypoxygen，CIH)[4]，而麻醉状态下慢性间歇性低氧大鼠是能够较好反映睡眠呼吸暂停反复低氧血症的动物模型，近几年来被广泛用于睡眠呼吸暂停的基础研究中[5]。本研究旨在通过建立慢性间歇性低氧麻醉大鼠模型，模拟睡眠呼吸暂停反复低氧和复氧的病理生理过程，探讨慢性间歇性低氧对麻醉大鼠心血管功能的改变，及其与心肌细胞凋亡的关系，从而探讨睡眠呼吸暂停对心血管功能的影响及发生机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物、仪器与试剂

健康成年雄性SD大鼠72只，动物合格证编号(72915502616)，体质量(284.45±14.78)g。所用仪器和试剂包括YS-1型数字式测氧仪、血压计、恒温加热箱、超声仪、硝酸还原酶、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 72只雄性SD大鼠按照随机数字表法分成3组，每组24只，分别为常氧对照组(对照组)、常氧麻醉组(模型组)和慢性间歇低氧组(低氧组)。对照组呼吸正常空气；模型组给予10%水合氯醛0.3 mL/kg腹腔注射麻醉；低氧组在模型组的基础上给予8 h/d慢性间歇低氧刺激，每天重复麻醉并低氧刺激。7 d后处死大鼠，取血浆及心脏标本用于检验。

1.2.2 低氧模型的构建 通过氮气稀释原理，在CIH舱中放置SD大鼠，并循环充入压缩空气45 s和氮气45 s，90 s循环周期，并通过调节气体流量，使每一循环舱内最低氧浓度达5%，然后逐渐恢复至21%，其中使用YS-1型数字式测氧仪测定氧浓度。在相同的有机玻璃舱内放置对照组和模型组大鼠，并向舱内循环充入压缩空气。

1.2.3 病理观察 取血后立即将大鼠心脏游离，称重后留取左心室固定、包埋、切片，行HE染色后光镜200倍观察心肌细胞形态、排列和炎症现象并摄片。

1.2.4 心肌细胞凋亡检测 采用缺口末端标记法检测心肌细胞凋亡率。摘取心脏标本后用4%多聚甲醛固定24 h，常规石蜡包埋，切片脱蜡入水后用蛋白酶K(20)消化15 min；1%H2O甲醇溶液封闭内源性过氧化物酶，加入20 μL TUNEL混合液，37 ℃孵化1 h，TBS液漂洗，封闭，加入生物素标记抗地高辛抗体50 μL，37 ℃孵化30 min，TBS漂洗，DAB显色，苏木素复染，计算凋亡率。凋亡指数=(凋亡阳性细胞核数/总细胞核数)×100%。

1.2.5 血压测定 于实验前和实验最后1 d结束时采用无创鼠尾动脉血压测量法测量大鼠尾动脉收缩压和舒张压，连续测量3次取平均值。

1.2.6 超声心动图检测左心室射血分数和左心室舒张期及收缩末期内径 使用大鼠超声仪，在胸骨旁短轴二尖瓣腱索水平引出M型曲线并进行测量左心室射血分数(LVEF)、左心室舒张期内径(LVID)及左心室收缩末期内径(LVDs)，连续测量3次取平均值。

1.2.7 左心室内压最大上升速率和最大下降速率检测 采用经左心室心尖部插管到达左心室，测量反映左心室内压最大上升率(dp/dtmax)和最大下降率(-dp/dtmax)的指标的方法，此方法需要进行开胸手术，暴露心脏，因此要用小动物人工呼吸机辅助呼吸。

1.2.8 红细胞和红细胞压积指标检测 麻醉开腹后用粗纱布去除腹部筋膜和其他组织，找到下腔静脉迸行采血，取血后在离心机上以3 500 r/min离心15 min，取上层血清并储存于-80 ℃，直到下次进行血清指标的分析时取出，用全自动血液分析仪测定红细胞(RBC)和红细胞压积(HTC)。

1.2.9 心肌酶谱指标 各组大鼠麻醉后行腹主动脉取血5 mL，于全自动生化分析仪检测心肌酶谱4项指标：肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、羟丁酸脱氢酶(HBDH)的含量。

1.2.10 血液学检测 心脏超声检查结束后立即处死大鼠，直接心脏取血，肝素抗凝。1 600 r/min离心5 min后取上清液，-80 ℃保存待测。血浆NO含量的测定采用硝酸还原酶测定法，血浆内皮素-1、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)测定采用酶联免疫吸附试验(ELISA)，按说明书进行操作。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠心脏HE染色

对照组大鼠心肌形态正常，细胞排列均匀，未见肿胀和炎症；模型组大鼠心肌细胞排列轻度较均匀，未出现肥大和炎性改变；低氧组大鼠心肌细胞变形，排列不均匀，细胞核大深染，心肌组织有比较明显的炎性变化(图1)。

a：对照组；b：模型组；c:低氧组

2.2 大鼠心肌细胞凋亡的影响

模型组大鼠心肌细胞凋亡率与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，低氧组大鼠心肌细胞凋亡率明显高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

*：与模型组比较，P<0.05

2.3 各组大鼠鼠尾血压比较

各组大鼠尾动脉舒张压比较，差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较，模型组大鼠尾动脉收缩压变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)，低氧组大鼠尾动脉收缩压明显高于对照组和模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠鼠尾血压比较±s，n=24，mmHg)

*：与对照组和模型组比较，P<0.05

2.4 各组大鼠超声心动图比较

低氧组大鼠的LVEF显著低于对照组和模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)。超声检测值提示低氧组大鼠LVID稍微变大，左心腔扩大，舒张功能尚正常，低氧组和模型组的LVDs均明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠超声心动图的比较±s,n=24)

*：与对照组和模型组比较，P<0.05

2.5 氧化应激指标的比较

与对照组比较，模型组的丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和过氧化物歧化酶(SOD)变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)。低氧组的血清MDA、GSH-PX和SOD显著高于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 各组大鼠氧化应激指标的比较±s,n=24)

*：与模型组比较，P<0.05

2.6 大鼠血液指标的比较

低氧组的血清内皮素-1水平显著高于对照组和模型组，而对照组和模型组变化不明显，低氧组的血清NO2-/NO3-总和显著低于对照组和模型组，而模型组也明显低于对照组。低氧组的血清eNOS水平显著低于对照组和模型组，而对照组和模型组变化不明显，见表4。

2.7 各组大鼠RBC、HCT、dp/dtmax和-dp/dtmax的变化

表5显示，与对照组比较，模型组大鼠RBC、HCT、dp/dtmax和-dp/dtmax变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)。低氧组大鼠的RBC、HCT显著高于对照组和模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，而低氧组大鼠的dp/dtmax和-dp/dtmax显著低于对照组和模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表4 各组大鼠血液指标的比较±s,n=3)

*：与模型组比较，P<0.05；#：与对照组比较，P<0.05

2.8 心肌酶谱指标的比较

与对照组比较，模型组大鼠的肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、羟丁酸脱氢酶(HBDH)的变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)，低氧组大鼠的血清CK、CK-MB和LDHD显著高于模型组，HBDH显著低于对照组，差异具有极显著性统计学意义(P<0.01)，见表6。

表5 各组血液RBC、HCT、血流动力学dp/dtmax、-dp/dtmax 的变化±s,n=24)

*：与模型组比较，P<0.05

*：与模型组比较，P<0.01

3 讨论

夜间长期、反复且间断的低氧容易导致机体各系统疾病的发生，这使得OSAHS成为造成机体损害的主要病理因素，对人类健康和生命构成严重威胁[6]。有研究发现患有睡眠呼吸暂停患者会出现血压升高、左室肥厚和左心功能不全等症状[7]，在麻醉过程中模拟慢性间歇性低氧的大鼠也出现了相似的症状，如大鼠心肌细胞排列不均匀，肥大、肿胀、核大深染、变形，心肌组织有明显炎性改变，大鼠尾动脉收缩压明显增加，超声检测值提示低氧组大鼠LVID稍微变大，左心腔扩大，且血流指标检测均出现异常。有研究通过对慢性间歇性低氧大鼠进行心导管检查发现[8]，在进行低氧干预后，大鼠的左心室舒张末期压力水平出现了明显升高的趋势，dp/dtmax和心输出量降低明显，这意味着间歇性低氧能够诱导左心功能不全的发生。有学者在全身麻醉状态下通过用气管套管钳夹犬气管[9]，通过3个月反复的模拟气道阻塞睡眠呼吸暂停实验，结果显示大鼠的LVEF下降明显，也得出了间歇性低氧可引起左心功能降低的可能机制，但左心室功能受损的机制目前尚不清楚。Chen等[10]每天将大鼠暴露于慢性间歇低氧(最低氧浓度4%～5%)8 h，共持续5周，定期测量血压和心率发现，第2周时间歇性低氧组血压高于对照组，但在第5周实验结束时这种动脉收缩压的差别消失，表明左心室功能不全可能不是由高血压、左心室肥厚引起，而是与反复低氧复氧直接引起心肌细胞损伤有关。

血管内皮细胞产生和分泌的内皮素-1是具有强烈的缩血管作用[11]。NO与内皮素-1是相拮抗的内皮源性舒张因子，由eNOS催化底物L-精氨酸合成。血管张力和血液动力学的调节是内皮素-1和NO共同参与的，可以有效反映血管内皮功能[12]。在OSAS的特征性的慢性间歇低氧过程中，过多氧自由基的产生打破了氧的平衡，导致氧化应激的发生，大大增加OSAHS患者患心血管疾病的风险[13]。本研究结果显示低氧干预使心肌氧化应激水平增高，心功能损伤，内皮功能紊乱且伴随着血压的升高，且这一系列的病理生理改变并不是独立存在的，而是具有一定的关联性[14-16]；这种损伤可能通过氧化应激引起血清内皮素-1、NO含量失衡，导致内皮功能障碍，进而损伤心肌有关。

心电图与心肌酶谱变化可在一定程度上反映心脏损伤的轻重[17-18]，当心电图明显异常或心肌酶同步增高，尤其当两者同时变化时，提示损伤严重[19]。本研究结果表明，间歇性低氧可以使左心射血分数降低，心肌酶水平不同程度增高，这说明低氧可能会抑制心功能。本实验考察了间歇性低氧对大鼠心电图和心肌酶谱的毒性作用，且在实验过程中发现心功能检测指标在心脏损伤时的作用机制尚未完全清楚，这需要更全面、深入的研究间歇性低氧对心脏的影响。

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