乌原鲤的胚胎发育特征

2018-06-04韩耀全何安尤蓝家湖吴伟军李育森王大鹏雷建军

水产科学 2018年3期

韩耀全,何安尤,蓝家湖,吴伟军,李育森,王大鹏,雷建军,施军

( 1.广西水产科学研究院,广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室,广西南宁 530021；2.广西都安瑶族自治县水产畜牧兽医局,广西都安 530700 )

乌原鲤(Procyprismerus)俗名乌鲤、乌钩、黑鲤、墨鲤等，属鲤形目、鲤科、鲤亚科、原鲤属，是珠江水系特有鱼类，仅分布于珠江流域西江水域部分干流及支流[1-2]。由于众多致危因素导致其自然资源日渐枯竭，已列为《中国濒危动物红皮书》濒危物种和《世界自然保护联盟濒危物种红色名录》易危物种[3]。国内外关于乌原鲤的研究极少，仅见有乌原鲤精子活力的影响[4]和寄生于乌原鲤鳃指环虫(Dactylogyrus)新种等[5]少量报道。近年来乌原鲤的资源保护工作受到重视，鱼类培育及繁殖工作已陆续开展，但有关乌原鲤生理生化、遗传学和人工繁殖及养殖增殖的研究成果少有公开发表报道。为了开展乌原鲤资源养护与增殖，笔者自2014年起展开了乌原鲤性腺发育及人工繁殖相关技术研究，2016年3月成功人工繁育出乌原鲤仔鱼3批次。全程观察乌原鲤胚胎发育过程，为乌原鲤资源保护增殖工作和相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 亲鱼催产、人工授精与孵化

乌原鲤亲本来自渔民捕获出售的成熟亲鱼及野生鱼苗池塘培育成熟的亲鱼，雌亲鱼体质量1.0～2.0 kg，雄亲鱼体质量0.8～2.5 kg。2016年3月8日、10日和26日，3次进行乌原鲤人工催产及胚胎发育观察。筛选性腺发育良好的亲鱼，按每千克体质量对雌鱼注射催产，催产药物为：1 mg鲤鱼脑垂体+20 μg促黄体素释放激素类似物+3 mg马来酸地欧酮，用0.9%氯化钠注射液研磨、溶解约至每尾鱼1 mL剂量。采取胸鳍基部1次性注射，注射后放入催产池中，流水刺激促产。试验雄鱼性腺发育良好，未注射催产药物。待发现催产池中亲鱼出现追逐，有产卵迹象时进行人工干法授精。受精卵置于微流水、连续充氧孵化桶中孵化，水温为(20±1) ℃和(15±1) ℃、溶解氧>7 mg/L。

1.2 胚胎发育观察

参考鱼类胚胎发育相关研究成果，描述乌原鲤胚胎各个发育阶段不同时期的发育特征[6-12]。通过OLYMPUS CX31生物显微镜和OLYMPUS SZ61体视显微镜对胚胎发育过程进行连续活体观察，利用OLYMPUS DP73显微镜成像系统和OLYMPUS cellSens Standard 1.6显微镜图像程序对各发育时期胚胎进行成像和采集。受精后至囊胚期前每隔10 min、囊胚期后至原肠晚期每30 min、原肠晚期后每60 min观察拍摄记录1次。随机取样20粒以上，观察，拍摄，记录各发育阶段的形态特征及发育时间，以50%胚胎进入某个发育阶段为该发育阶段的起始时间，自前一个发育阶段至下一个发育阶段的时间间隔为该阶段的持续发育时长。发育积温为某发育期平均水温与此发育期持续发育时长的乘积。

为清晰观察及拍摄胚胎发育图像，并观察经去膜处理胚胎的发育情况，试验同步观察未处理及经去膜处理胚胎的发育情况。乌原鲤卵膜不易通过物理方法剥离，采用Solarbio胰蛋白酶0.1%、0.25%、0.35%水解液对受精卵进行消化，消化3～10 min，消化时间达到后用Holtfreter培养液清洗并在培养液中继续培养发育，直至出膜。Holtfreter培养液为3.5 g NaCl+0.05 g KCl+0.1 g CaCl2+0.2 g NaHCO3溶解至1000 mL双蒸水中配制而成。

1.3 数据处理和分析

受精卵卵径、胚胎及出膜仔鱼等相关长度数据使用OLYMPUS DP73显微镜成像系统和OLYMPUS cellSens Standard 1.6显微镜图像软件内置测量程序采集及测量。选取3次试验观察拍摄获得的典型照片通过Adobe Photoshop CS 8.0.1软件处理后，作为各乌原鲤胚胎各发育阶段的特征模版照片。

2 结果

乌原鲤约4龄性成熟，为一次性产卵型鱼类[13]，产卵期2—4月。成熟卵子呈圆球形，亮黄色，卵径1.68～1.98 mm，具较强黏性。受精卵吸水膨胀后，卵径2.28～2.57 mm。乌原鲤胚胎发育与其他鱼类胚胎发育过程相似，历经受精、卵裂、囊胚、原肠胚、神经胚、器官形成及孵化出膜6阶段，每个发育阶段又有若干个发育时期[9-19]。在水温(20±1) ℃、溶解氧>7.0 mg/L条件下，乌原鲤受精至出膜时长为80.8 h，胚胎发育所需总积温为1616.0 ℃·h。

受精卵阶段：受精后1.50 h，胚盘隆起。本阶段历时2.22 h，积温44.4 ℃·h。

卵裂阶段：受精后2.22、3.07、3.93、4.82、5.90 h和7.13 h，分别进入2细胞期、4细胞期、8细胞期、16细胞期、32细胞期和多细胞期。本阶段2.22～9.02 h，历时6.80 h，积温136.0 ℃·h。

囊胚阶段：受精后9.02、10.42、12.17 h，分别进入囊胚早期、囊胚中期和囊胚晚期。本阶段9.02～15.37 h，历时6.35 h，积温127.0 ℃·h。

原肠胚阶段：受精后15.37、19.25、21.27 h，分别进入原肠早期、原肠中期和原肠晚期。本阶段15.37～21.88 h，历时6.51 h，积温130.2 ℃·h。

神经胚阶段：受精后21.88、22.47 h，分别进入神经胚期和胚孔封闭期。本阶段21.88～24.63 h，历时2.75，积温55.0 ℃·h。

器官形成阶段：受精后24.63 h肌节出现，26.42、28.55、30.85、31.77 h，眼基、眼囊、尾芽和尾鳍相继形成，34.97 h眼晶体出现，37.73 h进入肌肉效应期，40.37 h耳石出现，43.53心脏形成，52.38 h进入心脏搏动期。本阶段24.63～80.80 h，历时56.17 h，积温1123.4 ℃·h。

孵化出膜阶段：受精后80.80 h，仔鱼孵化出膜。本阶段历时47.45 h。其中初始出膜时间为71.33 h，25%出膜时间为78.60 h， 50%出膜时间80.80 h， 75%出膜时间为87.72 h，最迟出膜时间为128.25 h；水温(15±1) ℃时，乌原鲤受精卵至出膜时长为116.5 h，初始出膜时间为100.50 h，25%出膜时间为110.33 h，50%出膜时间为116.50 h，75%出膜时间为134.33 h，最迟出膜时间为164.50 h。

初孵仔鱼全长约6100 μm，体高1600 μm。卵黄囊呈前大后小漏斗形，后部约为前部最高的1/5～1/4。出膜后静卧水底，偶能挣扎弹起，不能游动；出膜24 h仔鱼全长6500 μm，体高1640 μm。卵黄囊前大后小，后部高约为前部最高的1/3；出膜48 h仔鱼全长7240 μm，体高1540 μm；出膜72 h仔鱼全长7970 μm，体高1390 μm。静卧水底，可偶尔弹起游动数秒。水温(20±1) ℃条件下乌原鲤胚胎发育过程各个发育时期主要特征见表1和图1。

3 讨论

3.1 乌原鲤胚胎发育特点

乌原鲤隶属的鲤科鲤亚科共有5属鱼类，分别为鲃鲤属(Puntioplites)、原鲤属(Procypris)、鲤属(Cyprinus)、须鲫属(Carassioides)和鲫属(Carassius)[1-2]，原鲤属、鲤属和鲫属鱼类有胚胎发育研究记载[14-18]，鲃鲤属和须鲫属尚未见相关报道。乌原鲤胚胎发育过程与相同亚科鱼类相似，但不同鱼类胚胎各发育时间及历时各有特点[14-18]。水温约20 ℃时，原鲤属的乌原鲤胚胎发育时长80.80 h，岩原鲤(P.rabaudi)90.57 h。鲤属的三角鲤(C.multitaeniata)为92.17 h，相差不大。鲤属的鲤鱼(C.carpio)胚胎发育时长为60.00 h，鲫属的鲫鱼(C.anratus)为59.08 h，时间较短。

乌原鲤与同属的岩原鲤相比，受精卵阶段至囊胚阶段发育时间基本相近，原肠胚阶段至器官形成阶段，岩原鲤胚胎发育相对较慢；水温约20 ℃时，乌原鲤出膜阶段持续时长47.45 h，比岩原鲤的27.43 h更长，二者均为尾部先出膜；乌原鲤与岩原鲤胚胎心脏搏动时间及各时期心率略有差异，岩原鲤受精后65.25 h心脏开始搏动，65.75 h心率38次/min，78.27 h(即开始搏动13 h后)心率60次/min，初孵仔鱼心率80～82次/min。乌原鲤受精后50.78 h心脏开始搏动，55.67 h心率40～45次/min，55.68～67.67 h心率60次/min，开始搏动17 h后，心率稳定在75次/min。

乌原鲤胸鳍原基出现较早，在尾鳍形成期已经出现。岩原鲤胸鳍原基在心脏原基形成阶段才形成[14]。

表1 乌原鲤胚胎发育特征

(续表1)

发育阶段发育时期发育时间/h发育阶段持续时间/h主要形态特征图解器官形成阶段晶体形成期34.97肌肉效应期37.73嗅窝耳石期40.37心脏形成期43.53心脏摶动期52.38脊索非常清晰,眼杯中可见晶体,卵黄体呈上肾形,肌节清晰。1v胚体延长,头部突出,尾的边缘出现皮褶,可见胚体微弱的间歇性颤动,颤动时间间隔及次数无规律。此时去膜胚胎直径1594 μm,高2489 μm。头尾间距718 μm。眼长305 μm,眼高268 μm,眼晶体直径117 μm。1w眼囊逐渐凹陷呈杯状,脊索前端的上方出现小泡状耳囊,尾鳍伸长,脊索可见,肌肉收缩加强,眼前方有一对浅的凹陷,耳囊出现小石粒。尾鳍长550 μm。1x尾部游离增长,在胚胎头部和卵黄囊之间可见葫芦状细胞串心脏原基。尾鳍长664 μm。1y尾部伸长,头部腹下方、卵黄囊正前方的心脏开始跳动,由弱到强,胚体伸直。开始搏动前面5 h跳动频率为40～45次/min,随后12 h跳动频率为60次/min,17 h后稳定在75次/min。1z孵出阶段出膜期80.8047.45胚体加速扭动,尾部不断拍击,通过扭动尾部顶破卵膜,自尾部脱膜而出。初孵仔鱼全长约6100 μm,体高1600 μm。出膜后静卧水底,偶能挣扎弹起,不能游动;出膜24 h仔鱼全长6500 μm。1aa1bb

3.2 温度对胚胎发育和仔鱼出膜的影响明显

温度对乌原鲤胚胎发育及出膜阶段影响明显。一是温度对胚胎发育时间影响明显。水温(15±1) ℃时乌原鲤受精卵至出膜时间为116.5 h，水温(20±1) ℃时为80.8 h。在温度较低的条件下，胚胎发育相对迟缓，前期各阶段发育时间相差较小，后期阶段相差较大；二是温度对出膜阶段影响明显。在水温(15±1) ℃时胚胎25%～75%出膜持续时长24 h，从初始出膜到完全出膜持续时长约64 h。而在水温(20±1) ℃时胚胎25%～75%出膜持续时长为9 h，从初始出膜到完全出膜持续时长约57 h。可见水温(20±1) ℃比水温(15±1) ℃仔鱼出膜时间更早、出膜更同步、出膜时段更集中。此外，无论(15±1) ℃还是(20±1) ℃条件下，乌原鲤出膜阶段持续时长均接近50 h，与岩原鲤在相同条件下发育卵孵化的时间差达30 h有类似现象[18]，其相关机理及影响有待研究。

3.3 去膜处理有利胚胎发育观察研究

对胚胎进行去膜处理，可以更清楚观察及展现胚胎发育情况，有些胚胎发育研究直接采用经脱膜胚胎发育的观察结果[19-21]。乌原鲤受精卵具黏性表面易黏连异物，且卵膜较厚，去膜处理有利观察胚胎内部情况。本试验采用胰蛋白酶水解液对部分受精卵进行脱膜，同步观察未处理及经去膜处理胚胎的发育情况。结果显示，经3种剂量消化液脱膜处理的胚胎均能发育良好，与未脱膜处理的胚胎发育进程基本同步，直至孵化出膜的各发育阶段均未发现明显发育差异。胚胎经短时间消化处理，卵膜在较短时间内不会完全脱落，但能去除部分表面卵膜及黏连的异物，视野会更清晰，有利观察和拍摄。受精卵移出消化液经Holtfreter培养液清洗并移入培养液中后，酶作用并未完全停止，消化尚在缓慢进行，时间稍长，部分受精卵膜会整体完全脱落。使用胰蛋白酶水解液消化脱膜要控制好消化时间，在显微镜下注意观察，不能过度消化，避免胰蛋白酶对细胞造成损伤。

表2 鲤亚科鱼类胚胎发育进程 h

图1 乌原鲤的胚胎发育1a：受精卵；1b：胚盘隆起；1c：2细胞期；1d：4细胞期；1e：8细胞期；1f：16细胞期；1g：32细胞期；1h：多细胞期；1i：囊胚早期；1j：囊胚中期；1k：囊胚晚期；1l：原肠早期；1m：原肠中期；1n：原肠晚期；1o：神经胚期；1p：胚孔封闭期；1q：肌节形成期；1r：眼基形成期；1s：眼囊形成期；1t：尾芽出现期；1u：尾鳍形成期；1v：晶体形成期；1w：肌肉效应期；1x：耳石形成期；1y：心脏形成期；1z：心脏摶动期；1aa：初孵仔鱼(前部侧面)；1bb：初孵仔鱼(前部背面).

参考文献：

[1] 周解,张春光,甘西,等.广西淡水鱼类志[M].2版.南宁:广西人民出版社,2006:346-348.

[2] 王幼槐.中国鲤亚科鱼类的分类、分布、起源及演化[J].水生生物学集刊,1979,6(4):419-438.

[3] 乐佩奇,陈宜瑜.中国濒危动物红皮书:鱼类[M].北京:科学出版社,1998.

[4] 吴清毅,孙翰昌,李云瑶.不同浓度的K+、Ca2+和葡萄糖对乌原鲤精子活力的影响[J].水产科学,2011,30(4):202-205.

[5] 张剑英,郭起治.寄生于乌原鲤鳃上之指环虫两新种的记述[J].水产学报,1984,8(1):69-73.

[6] 刘筠.中国养殖鱼类繁殖生理学[M].北京:农业出版社,1993.

[7] 楼允东.组织胚胎学[M].北京:中国农业出版社,2000.

[8] 姜海峰,耿龙武,佟广香,等.池养镜泊湖蒙古鲌的人工繁殖及胚胎发育和胚后发育观察[J].水产科学,2016,35(2):130-135.

[9] 郭文学,张永泉,张有全,等.黑斑狗鱼胚胎发育的研究[J].水产学杂志,2015,28(2):16-21.