不同测定方法对聚维酮碘杀菌效果的比较研究

陈 璇，张飞飞，陈志永，隗黎丽，范玉顶，张家奇，徐 敏，汤百福，刘 彧，钟其旺

( 1.江西农业大学，江西 南昌 330045； 2.中国水产科学研究院长江水产研究所，湖北 武汉 430223 )

黄鳝(Monopterusalbus)是我国重要的淡水经济鱼类之一，具有很高的食用价值和药用价值[1]。随着人工养殖密度的增加、集约化程度的提高，使得黄鳝更易受到病原菌的侵害，大量疾病相继爆发，而嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)就是常见的致病菌之一[2-4]。嗜水气单胞菌广泛存在于自然界的各种水体，是一种条件致病菌，当环境因素(如温度、氧含量、氨氮含量等)发生骤变时易导致疾病的爆发，如败血症、溃疡和细菌性肠炎等[5]。不仅如此，嗜水气单胞菌还是一种典型的人兽鱼共患病病原菌，对爬行动物、两栖动物、鸟类、哺乳动物以及人类都具有致病性[6]。为了减少养殖业的损失和保障人类的健康，消毒剂的使用就显得尤为必要。聚维酮碘，又名聚乙烯吡咯烷酮碘，具有低毒、高效、广谱的特点，是水产和医学上常用的消毒剂。对于聚维酮碘杀菌效果的测定，常采用试管二倍稀释法[9-10]和直接作用法[11-12]，两种方法的差异主要是反应时间和作用体系的不同。此前，已有研究证明有机物的存在会降低聚维酮碘杀菌的有效性[13-15]，而试管二倍稀释法的作用体系内含有液体培养基，推测培养基的存在会降低试管二倍稀释法测定结果的可靠性和准确性。故本研究拟同时采用试管二倍稀释法和直接作用法测定聚维酮碘对嗜水气单胞菌的杀菌效果，比较两种方法中有效碘的含量，同时评估聚维酮碘对黄鳝的毒性效果，以期为生产实践和实验室养殖中嗜水气单胞菌的防治提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

聚维酮碘(碘含量11%～12%)，四川正泰动物制药公司生产；试验中使用的培养基为溶菌肉汤培养基、营养肉汤培养基和双倍营养肉汤培养基，pH 7.3；可溶性淀粉(国药)；所有试剂均为分析纯。试验菌株为本实验室分离的来自患病黄鳝的6株嗜水气单胞菌(Ah1～Ah6)。黄鳝(体质量为10～20 g)取自江西洪瑞黄鳝养殖场。试验前黄鳝在曝气除氯的自来水中暂养7 d，水温(25±1) ℃，每日下午投饵一次，换水一次。挑选健康、无外伤的黄鳝进行毒性试验。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液制备

将6株嗜水气单胞菌分别接种于液体培养基中，25 ℃摇床培养至OD600≈ 0.5，10 000 r/min离心5 min，弃上清液，用无菌双蒸水重悬，重复以上步骤3次，获得菌悬液。

1.2.2 0.1%可溶性淀粉溶液配制

精确称取0.1 g可溶性淀粉粉末，加入含有双蒸水的烧杯中，加热至溶液澄清透明，冷却后定容至100 mL备用。可溶性淀粉溶液需现配现用。

1.2.3 试管二倍稀释法测定聚维酮碘的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度

将聚维酮碘粉末分别用无菌的溶菌肉汤、营养肉汤和双倍浓度营养肉汤培养基配制成8 g/L的母液，再用相应的液体培养基进行稀释至终质量浓度为4、2、1、0.5、0.25、0.125 g/L。取0.1 mL菌悬液接种于含有聚维酮碘的培养基中(终约2×106cfu/mL)，作为试验组；取0.1 mL菌悬液以同样方法接种于不含聚维酮碘的培养基中，作为对照组。将试验组和对照组均置于25 ℃恒温避光条件下培养24 h后观察结果。以无菌生长(肉眼观测液体透明澄清)、稀释度最大的聚维酮碘质量浓度作为各菌株的最小抑菌质量浓度。从聚维酮碘作用后无菌生长的试管中取100 μL溶液，再加入等量的中和剂(0.004 mol/L硫代硫酸钠)作用10 min后，涂布于相应的无菌琼脂平板上，过夜培养后平板上仍无细菌生长的最低聚维酮碘质量浓度作为最小杀菌质量浓度。以上试验重复3次。

1.2.4 直接作用法测定聚维酮碘杀菌效果

将聚维酮碘粉末用双蒸水配制成100、50 mg/L的溶液，取出100 μL加入到含有900 μL菌悬液的离心管中(终约2×106cfu/mL)。25 ℃恒温避光孵育0、10、30、60 min之后，每管分别取150 μL加入等量的中和剂，作用10 min后，取100 μL进行梯度稀释并涂布于无菌琼脂平板上，过夜培养后计数，根据稀释倍数推算出100 μL涂布液中的细菌总数。进行3次独立重复试验。

聚维酮碘处理后嗜水气单胞菌的存活率=处理后细菌总数/处理前细菌总数

1.2.5 有效碘含量测定

有效碘含量的测定参考文献[16]的方法，略有改动。将聚维酮碘的粉末用无菌培养基(溶菌肉汤、营养肉汤和双倍浓度营养肉汤)或双蒸水配制成质量浓度为4、2、1、0.5 g/L的溶液。分别取上述溶液1 mL加至含有2 mL 0.1%可溶性淀粉溶液的离心管中，混匀后取1.5 mL于585 nm(最大吸收波长)处测吸光度，剩余1.5 mL溶液置于25 ℃恒温箱中避光放置24 h后再次测定吸光度。所有吸光度的测定均以未加聚维酮碘的上述混合液(1 mL溶菌肉汤/营养肉汤/双倍浓度营养肉汤/双蒸水和2 mL 0.1%可溶性淀粉溶液的混合液)作为空白对照，进行调零。以OD585 nm的数值来反映有效碘的含量。以上试验均进行3次重复。

1.2.6 聚维酮碘对黄鳝的急性毒性

采用静水法[17]测定聚维酮碘对黄鳝(13.36±2.51) g的毒性效果。分别将聚维酮碘粉末加入至2 L除氯自来水中至终质量浓度为100、150、175、200、250 mg/L，每组放入健康黄鳝10尾，试验期间避光不喂食不换水，每个质量浓度设置3组平行。连续观察24 h，记录各质量浓度组黄鳝的死亡数目并清理死亡黄鳝(以丧失游动能力和掐尾无反应作为死亡标准)，计算聚维酮碘对黄鳝的半数致死质量浓度。

1.3 数据处理和分析

采用Excel软件对数据进行初步整理，使用SPSS 17.0统计软件对数据进行差异显著性分析。

2 结 果

2.1 试管二倍稀释法测定聚维酮碘杀菌效果

在不同培养基存在下，聚维酮碘对嗜水气单胞菌作用24 h后，各试验组表现出不同程度的澄清和浑浊现象。对培养后仍澄清的菌液进行平板计数，发现部分澄清菌液中仍有活菌存在。在溶菌肉汤和营养肉汤培养基中，聚维酮碘对6株嗜水气单胞菌的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度均为2 g/L；在双倍浓度营养肉汤培养基中，聚维酮碘对3株嗜水气单胞菌(Ah1～3)的最小抑菌质量浓度为2 g/L，最小杀菌质量浓度为4 g/L，对另外3 株菌(Ah4～6)的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度均为4 g/L(表1)。

2.2 直接作用法测定聚维酮碘杀菌效果

直接作用法的结果显示，尽管不同嗜水气单胞菌菌株对聚维酮碘的敏感性各不相同，但聚维酮碘对各菌株均有良好的杀菌效果(表2)，5 mg/L聚维酮碘在10 min内对6株嗜水气单胞菌的杀灭率高达99.99%以上，10 mg/L聚维酮碘在10 min内杀灭率为100%。

2.3 培养基对聚维酮碘有效碘含量的影响

不同溶液在585 nm的吸光度均随聚维酮碘质量浓度的增加而升高(表3)。当聚维酮碘的质量浓度相同时，不同溶液展现出不同的效果，双蒸水中有效碘的含量最高，其次是溶菌肉汤培养基和营养肉汤培养基，而双倍营养肉汤培养基中有效碘的含量最低。当聚维酮碘的质量浓度为4 g/L时，不同溶液的吸光值由高到低依次为双蒸水(>4)、溶菌肉汤(0.1123)、营养肉汤培养基(0.0607)、双倍浓度营养肉汤培养基(0.0302)。放置24 h后，所有反应液的吸光值均下降，说明有效碘含量减少，其中，双蒸水中吸光值降幅最大，但仍远高于其他培养基。

2.4 聚维酮碘对黄鳝的急性毒性测定

黄鳝在聚维酮碘质量浓度为100～250 mg/L的曝气自来水中均出现了前期鱼体剧烈游动的现象，部分黄鳝后期出现游动能力减弱和持续抬头呼吸及死亡等不正常现象，而且随着聚维酮碘质量浓度的升高，死亡率逐渐增加，当聚维酮碘质量浓度为250 mg/L时，黄鳝全部死亡。而低质量浓度处理组(100 mg/L)和对照组黄鳝在整个试验期间均未出现死亡的现象。聚维酮碘质量浓度与黄鳝死亡率的相关性方程为：y=0.0069x-0.7[r2= 0.9804，其中y表示黄鳝的死亡百分率，x表示聚维酮碘的质量浓度(mg/L)，r2表示相关系数]。由此计算得出聚维酮碘对黄鳝的24 h半致死质量浓度为173.91 mg/L。

表1 聚维酮碘对嗜水气单胞菌的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度(n=3)

表2 不同质量浓度聚维酮碘对嗜水气单胞菌的杀菌效果(平均值±标准差)

注：**表示同行数据(平均值±标准差)经LSD法比较在P<0.01水平上差异显著.

表3 不同溶液中聚维酮碘有效碘含量随时间的变化(平均值±标准差)

注：不同字母表示同行数据(平均值±标准差)经LSD法比较在P<0.01水平上差异显著；*表示同一聚维酮碘质量浓度下0 h和24 h间的有效碘含量经LSD法比较均存在显著性差异(P<0.05).

3 讨 论

3.1 聚维酮碘杀菌测定方法比较

聚维酮碘是一种广谱消毒剂，对细菌、真菌、孢子和部分寄生虫[18]均有良好的杀灭效果[19]。其通过与病原体的巯基化合物、蛋白质、脂质等发生碘化反应，以达到破坏膜结构并杀死病原体的效果[20]。目前，聚维酮碘杀菌效果的测定方法主要有两种，为试管二倍稀释法和直接作用法，两种方法测得的有效杀菌质量浓度间存在较大差异。杨移斌[10]等采用试管二倍稀释法研究了聚维酮碘对各种病原菌的杀菌效果，其中弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)和鲁氏耶尔森氏菌(Yersiniaruckeri)对聚维酮碘的敏感性最强，最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度分别为128 mg/L、1024 mg/L，嗜水气单胞菌的敏感性最弱，最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度分别为256 mg/L、2048 mg/L；谭凤霞[9]发现聚维酮碘对不同气单胞菌菌株的最小抑菌质量浓度为125～250 mg/L，最小杀菌质量浓度为4～8 g/L。Mainous等[11-12]采用直接作用法发现在双蒸水中，25 mg/L聚维酮碘对分支杆菌(Mycobacterium)的杀菌率5 min内可达100%，而50 mg/L聚维酮碘在1 min内即可完全杀灭迟缓爱德华菌(Edwardsiellatarda)。两种方法获得的结果间的差异可能是由菌株的差异性或测定方法的不同所致，故笔者同时采用两种方法测定聚维酮碘对黄鳝源嗜水气单胞菌的杀菌效果，以消除菌株间的差异对结果的影响。结果表明，使用试管二倍稀释法时，在溶菌肉汤培养基和营养肉汤培养基中，聚维酮碘对嗜水气单胞菌(Ah1～6)的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度均为2 g/L；在双倍营养肉汤培养基中，聚维酮碘对6株嗜水气单胞菌(Ah1～6)的最小抑菌质量浓度为2～4 g/L，最小杀菌质量浓度均为4 g/L。而使用直接作用法时，5 mg/L聚维酮碘在10 min内对6株嗜水气单胞菌的杀菌率即可达99.99%。这说明测定方法的不同直接导致结果的差异，而这两种测定方法间的差异主要在于反应体系的不同，前者添加有机培养基，而后者仅为双蒸水。细菌培养基成分复杂，富含有机物，而有机质会中和有效碘[13,21-22]，导致聚维酮碘杀菌效率的下降。不同培养基对有效碘的中和效果不同，培养基浓度越高，有机质的含量越多，有效碘的含量就越低，这直接导致了其在不同培养基中杀菌效率的不同。通过对有效碘的测定，也证实了培养基的确导致有效碘含量的显著下降。

由于聚维酮碘刺激性小、作用时效长、无残留毒性，故常用于鱼卵和水生动物体表的杀菌，但环境中诸多因素均能对聚维酮碘的有效性造成影响，如温度、光照、pH和有机物的存在等。一般胚胎消毒过程中，会漂洗去除过量的有机物，这主要是由于有机物的存在会降低聚维酮碘的有效性。当小牛血清、血液、黏液存在时，均能弱化聚维酮碘的杀菌效果[20]。在医学上，研究聚维酮碘的杀菌效果时，通常会加入少量的小牛血清蛋白，以模拟皮肤或黏膜表面[15,25-26]。但在水产养殖中，虽然养殖水体中含有机物，但其含量远未及培养基中丰富，故相比于试管二倍稀释法，采用直接作用法更加合理，准确性也更高。因而在测定养殖水体中聚维酮碘对各种病原菌的杀菌效果时，推荐使用直接作用法。

3.2 聚维酮碘对黄鳝的毒性作用

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