扭转原肠胚形成同系物1基因过表达对人胃腺癌细胞株BGC-823增殖的影响

袁静怡，曾嘉丽，帅春，刘玥，3

(1南方医科大学基础医学院，广州 510515；2 广东省妇幼保健院；3广东省生物芯片重点实验室)

胃癌是来源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，发病率居于恶性肿瘤第五位[1]，病死率居于癌症病死率第二位[2,3]。我国胃癌发病率居高不下[4]。目前临床尚无有效的胃癌治疗方法。扭转原肠胚形成同系物1(TWSG1,在非哺乳类脊椎动物中称为Tsg)是一种高度保守的分泌蛋白，最早发现于果蝇属中[5],其表达产物是分泌型的BMP绑定糖蛋白，参与多种疾病的调控[6]。研究[7]发现，TWSG1基因在胆管癌和肝癌组织细胞中的表达量比正常细胞明显升高。在人恶性间皮瘤中，TWSG1基因启动子区域CpG岛的异常甲基化可能促进肿瘤细胞生存能力，或当暴露于分化不利的条件时，将会导致肿瘤异质性[8]。Alexandra 等[9]研究发现，在结直肠癌中TWSG1可能是一个典型的癌症抑制基因。因此，可推测TWSG1在不同肿瘤的发生、发育、转移过程中的作用机制存在差异。而有关于TWSG1基因在胃腺癌发生、发展中的作用机制相关报道较少。2016年1月～2017年6月，我们构建TWSG1基因真核表达质粒，并用其转染人胃腺癌细胞株BGC-823，观察其对BGC-823细胞增殖的影响。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器 感受态大肠杆菌DH5α为本实验室制备，人胃腺癌BGC-823细胞和pTSB-CMV-MCS-SBP-3Flag-EGFP-F2A-PuroR质粒为南方医院中心实验室保存。BGC-823于RPMI-1640完全培养基中培养(内含10%灭活小牛血清+1%双抗(100 units/mL 青霉素和100 μg/mL链霉素)。细胞置于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养，并进行常规更换培养液与传代操作。质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司)、限制性内切酶、DNA Ladder、核酸胶回收试剂盒，以及T4DNA连接酶和Taq聚合酶(Takara公司)，转染试剂脂质体LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)，Trizol(Invitrogen公司)、逆转录试剂盒(Invitrogen公司)，SYBR Premix Ex Taq TMⅡKit(Takara公司),RIPA细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)，PVDF膜(millipore公司)，TWSG1兔抗人多克隆抗体(Abcam公司)，HRP标记的羊抗兔IgG(北京天德悦公司)，ECL发光液(美国Thermo Scientific Pierce公司)，CCK8(日本DOJINDO)。细胞培养皿(Corning公司)、六孔板(Corning公司)、EP管(Corning公司)和八联管(Corning公司)。测序由上海生工公司完成，克隆引物和RT-qPCR引物由上海生工公司合成。离心机(Beckman公司)； Infinite M200酶标仪(Tecan公司)；NanoDrop2000超微量分光光度计(Thermo公司)；小型水平电泳仪(Bio-Rad公司)；EclipseTi-s荧光倒置显微镜(Nikon公司)；7500Real-TimePCR仪(AppliedBiosystems公司)。

1.2 TWSG1基因真核表达质粒的构建 扩增TWSG1基因，上下游引物分别为5′- GAATTCATGAAGTTACACTATGTTGCTGTG-3′；5′- GGATCCTTAAAACATGCAGTTCATACATTTG-3′，反应条件为95 ℃、5 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s，72 ℃、30 s，共40个循环。扩增产物和pTSB-CMV-MCS-SBP-3Flag-EGFP-F2A-PuroR质粒同时采用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后进行连接，转化感受态大肠杆菌DH5a，挑取阳性菌落。菌落扩大培养后按照天根质粒小提试剂盒步骤进行质粒的抽提，用NanoDrop2000超微量分光光度计测定质粒DNA浓度及纯度，用EcoR Ⅰ和BamH I进行双酶切鉴定，根据DNA Ladder鉴定目的基因克隆的正确性，并将酶切鉴定为阳性克隆质粒进行测序鉴定。

1.3 BGC-823细胞分组及TWSG1真核表达质粒转染 取对数生长期细胞接种于6孔板中，将细胞分为观察组和对照组，待细胞汇合率达70%～80%时观察组和对照组分别转染TWSG1真核表达质粒、空白质粒载体，所有操作均按照LipofectamineTM2000脂质体说明书进行。然后加入1 μg/mL嘌呤霉素筛选至出现单克隆，取多个单克隆分别加入0.5 μg/mL嘌呤霉素继续培养，筛选稳定表达TWSG1的细胞株。经鉴定后观察组重组表达质粒测序鉴定结果测序结果与NCBI收录的人TWSG1基因序列完全相同。

采用Real-Time PCR法检测两组细胞TWSG1基因。采用TRIzol提取总RNA，扩增TWSG1基因，上下游引物分别为5′-GGTCATATGAGAAGCAGGTG-3′；5′-GTGTGCTAACAGTAGCACATG-3′，以GAPDH为内参，上下游引物分别为5′-CAAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3′；5′-CATACCAGGAAATGAGCTTGAC-3′，反应条件为95 ℃预变性30 s；95 ℃10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃30 s，40个循环。TWSG1相对表达量以2-ΔΔCt表示，ΔΔCt=[(样本Ct目的基因-样本Ct内参基因)-(对照组Ct目的基因-对照组Ct内参基因)]。 采用Western blotting法检测TWSG1蛋白。收集各组细胞，加入RIPA细胞裂解液提取蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，进行SDS-PAGE电泳，转PVDF膜，封闭后加入一抗(1∶1 000稀释)4 ℃孵育过夜，二抗(1∶6 000稀释)室温孵育1 h，ECL化学发光。用图像分析系统分析,以相应目的蛋白条带的积分光密度值表示TWSG1蛋白的表达情况。实验重复3次，取平均值。

1.4 两组细胞增殖情况观察 采用CCK-8法。取转染48 h各组细胞，接种于96孔板内，每组设9孔，每孔约1×103个细胞，连续培养3天。分别于24、48、72 h取出3孔细胞，每孔加入10 μL CCK-8试剂，37 ℃、5% CO2的培养箱孵育4 h后，酶标仪在450 nm波长处测定并记录各组光密度值(OD值)。

2 结果

两组细胞TWSG1基因及蛋白相对表达量比较见表1。

表1 两组细胞TWSG1基因及蛋白相对表达量比较

注：与空白组比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05。

培养24、48、72 h时两组细胞OD值比较见表2，两组细胞生长曲线见图2。与对照组比较，培养24、48、72 h时观察组细胞OD值均降低(P均<0.05)。

表2 培养24、48、72 h时两组细胞OD值比较

注：与空白组、对照组比较，*P<0.05；与本组前一培养时间比较，#P<0.05。

图2 两组细胞生长曲线

3 讨论

TWSG1基因编码保守性的疏水蛋白，在非洲爪蟾蜍中，Tsg通过其与腱蛋白相似的富含半胱氨酸残基的结构域直接与BMPs结合[10]。目前关于TWSG1的大部分研究是探讨其通过BMP信号调节铁调素的表达，有研究认为TWSG1能下调铁调素的表达[11,12],其机制可能与BMP信号转导有关。Forsman 等[13]发现TWSG1可通过激活BMP信号通路，促进乳腺导管分支、簇状结构形成等发育过程，而Yamada 等[14]发现在肾小球硬化症中 TWSG1是BMP主要的负调节因子。目前关于TWSG1的大部分研究是探讨其通过BMP信号调节铁调素的表达，TWSG1能下调铁调素的表达[15,16],其机制可能与BMP信号转导有关[17]，Tanno 等[18]发现TWSG1在β-球蛋白生成障碍性贫血老鼠中表达显著上调。同时，国内有研究[19]发现TWSG1在慢性高原病大鼠的肝组织中表达上调。此外，TWSG1参与许多生长发育进程，Tanno 等[20]发现其可调控早期胚胎发育， Heinke 等[21]认为其参与血管细胞的动态平衡调节。

从目前的研究状况来看，TWSG1对不同的肿瘤细胞的调控具有双向性，有研究发现在结直肠癌中TWSG1可能是一个典型的癌症抑制基因[9],其在许多结直肠癌组织中检测到存在缺失。此外，Forsman 等[22]发现在小鼠乳腺发育的重要时间点均有TWSG1的表达，其对乳腺癌的发生起到重要作用。而Xia 等[23]发现TWSG1在转移型乳头状甲状腺癌中的表达高于非转移型乳头状甲状腺癌，敲低TWSG1的表达能够抑制转移型乳头状甲状腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，由此推断其可能是乳头状甲状腺癌的新型诊断以及治疗靶点。他们还发现当TWSG1在K1细胞表达下调时，Id1和p-Smad1/5的mRNA和蛋白表达水平显著下降。而当TWSG1在TPC1细胞中过表达时Id1和p-Smad1/5的表达也增强。他们推论TWSG1可以激活乳头状甲状腺瘤细胞中的BMP信号通路。Johnston 等[7]通过对含有肝癌和胆管细胞癌的组织芯片进行免疫组化分析，发现免疫组化和WB的结果均显示胆管细胞癌的TWSG1表达量高于肝癌，且高表达于上皮细胞区域，而通过免疫组化技术发现BMP4也高表达于胆管细胞癌，此差异有统计学意义。于此同时，他们检测到TWSG1高表达于人胆管细胞癌细胞系(OZ;Huh-28;HuCCT-1)和人肝癌细胞系HepG2,但是在人肝正常上皮细胞THLE-3内不表达。而通过WB技术发现BMP4也高表达于人胆管细胞癌细胞系(OZ;Huh-28;HuCCT-1)，在HepG2和THLE-3细胞中均有一定表达。因此他们推断肝癌和胆管细胞癌组织中TWSG1的高表达能够激活BMP4分子，进而激活BMP信号通路。

然而，关于TWSG1对胃癌的作用的研究报道就十分有限，有研究[24]发现NKX6.3是小鼠胃部幽门中G/D细胞系的一种选择性调控因子，其可直接结合TWSG1基因转录起始位点的启动子上游序列，从而提高TWSG1的mRNA和蛋白表达量。与此同时，NKX6.3并不会影响BMPR-II蛋白表达量。接着通过免疫共沉淀技术发现在AGS细胞和MKN1细胞中NKX6.3诱导TWSG1与BMP4分子结合，并抑制BMP4分子与BMPR-II分子的结合，而沉默NKX6.3或TWSG1基因能使BMP4分子重新与BMPR-II分子结合。当BMP4分子与BMPR-II分子的结合受到抑制时，能导致BMP-SMAD信号通路失活，最终抑制胃黏膜的肠化生，减少胃癌的发生率。

综上所述，TWSG1基因过表达可抑制BGC-823细胞的增殖。

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