血清胆红素在肺癌患者中的抗氧化作用

刘利东 马梓欣 林琪英 周承志

广州医科大学附属第一医院1检验科，2输血科，4广州呼吸健康研究院、呼吸疾病国家重点实验室、国家呼吸系统疾病临床医学研究中心（广州 510120）；3广州医科大学金域检验学院（广州 510182）

胆红素是体内铁卟啉类化合物的降解产物，主要来源于衰老红细胞。血清胆红素作为肝胆及血液系统疾病的诊断和治疗指标在临床应用广泛，并一直认为其浓度升高对人体有害［1］，事实上胆红素具有强还原性，在首次被确认为内源性抗氧化剂后［2］，它的抗氧化功能越来越受到重视。胆红素在多种疾病发病过程中起重要作用，其中包括恶性肿瘤，但并不具有特异性［3］。肺癌的发生受多种因素影响，肺癌组织存在氧化/抗氧化失衡，这种失衡可能与肺癌的发生和发展有关［4］。有研究［5-7］表明在正常范围内较高的胆红素可以降低肺癌的发病率，提示胆红素可能对肺癌的发生有一定的抑制作用。为探明胆红素是否通过抗氧化作用对肺癌的发生造成影响，本文将通过测定血清胆红素、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和自由基作用于脂质的终产物丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量，分析它们之间的相关性，了解肺癌患者体内存在的氧化应激状态及胆红素在其中的作用。

1 材料与方法

1.1 标本来源

1.1.1 肺癌患者组2013年1月至2014年11月在广州医科大学第一附属医院确诊为肺癌患者为病例组。入选本次研究病例标准为：（1）原发性肺癌，经细胞学或组织病理学确诊，符合美国胸科医师学会（The American College of Chest Physicians，ACCP）肺癌诊治标准；（2）经病理免疫组化及腹部B超、CT或MR等检查排除肝胆系统疾病及其他肿瘤；（3）既往无其他肿瘤病史；（4）未进行化疗、放疗及手术切除等治疗。最终入选402例，其中男234例，女168例，年龄27～86岁，平均（60.09±9.9）岁。按美国联合癌症分类委员会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）和国际癌症研究协会（International Association for the Study of Lung Cancer，IASLC）2009年制定的TNM分期标准（第7版）［8］进行分期，其中 T1 72例，T2 147例，T3 95例，T4 88例。

1.1.2 对照组随机抽取同时期广州医科大学第一附属医院体检中心体检人群，排除心、脑、肝、胆、肾、内分泌疾病及肿瘤等疾病，最终入选422例，其中男199例，女220例，年龄22～80岁，平均（47.15±10.97）岁。

1.2 仪器与试剂胆红素检测仪器为Beckman Coulter AU5821全自动生化分析仪及配套试剂、标准品及质控品；SOD和MDA测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，分别采用黄嘌呤氧化酶法（羟胺法）和硫代巴比妥酸法（TBA法）。

1.3 标本采集和处理

1.3.1 对照者于清晨空腹采取静脉血3 mL，患者于入院后次日清晨空腹采取静脉血3 mL，选用含分离胶负压采血管采血。室温，3 300 r/min离心4 min，总胆红素及结合胆红素的检测为离心后立刻检测，SOD及MDA则取血清置于-40℃冰箱保存，并在3个月内检测。

1.3.2 总胆红素及结合胆红素含量的检测仪器为Beckman Coulter AU5821全自动生化分析仪，试剂为Beckman Coulter配套重氮法检测胆红素试剂盒；104例肺癌患者（其中T1-T4分期分别有16例、35例、31例和22例）和57例健康对照者检测SOD活性与MDA含量的检测，操作按试剂说明书进行手工操作，吸光度用752紫外光栅分光光度计进行测定。

1.4 统计学方法所有实验数据采用SPSS 19.0软件进行统计分析，计量数据用均值±标准差表示，组间均值比较采用独立样本的t检验，相关性分析应用配对样本的t检验，当P＜0.05时为组间差异具有显著性。

2 结果

2.1 对照组与肺癌组胆红素、SOD和MDA的测定结果肺癌组结果与对照组进行比较，总胆红素、结合胆红素及未结合胆红素和SOD均有明显的下降（P＜0.05），而MDA则显著性升高（P＜0.05）（表1）。这一结果提示，肺癌患者体内胆红素和SOD水平降低，可能导致患者体内抗氧化能力不足的原因，使细胞更容易遭到体内产生的氧化物质的破坏，促进细胞癌变。

表1 对照组与肺癌组胆红素、SOD和MDA的测定结果Tab.1 The concentrations of bilirubin,SOD and MDA in controls and patients with lung cancer ±s

表1 对照组与肺癌组胆红素、SOD和MDA的测定结果Tab.1 The concentrations of bilirubin,SOD and MDA in controls and patients with lung cancer ±s

注：△部分样本检测，对照组检测57例，肺癌组检测104例

2.2 对照组与不同肺癌分期的测定结果为进一步研究胆红素是否与肺癌的发展有关，本研究组按肺癌TNM分期标准将肺癌患者分为T1、T2、T3及T4四组，比较对照组与不同分期肺癌患者差异。对照组总胆红素、结合胆红素、未结合胆红素、SOD和MDA与肺癌T1～T4组进行比较，结果显示总胆红素和未结合胆红素T1～T2期与对照组差异无显著性，与T3～T4组则差异有统计学意义（P＜0.05），而结合胆红素与T2～T4组差异有显著性（表2）。对照组SOD和MDA与T1～T4组均差异有统计学意义（P＜0.05）（表3）。虽然T1～T4各组间所有检测项目有一定的变化趋势，但统计学分析相邻组间差异并没有显著性（P＞0.05，数据未显示）。提示胆红素可能是在肺癌的发展中起作用，而在早期肺癌发生时变化并不明显。

2.3 胆红素与性别关系有研究［9-10］认为胆红素与性别有关，为了解性别差异对胆红素的影响，我们将对照组男女之间及肺癌组男女之间的胆红素进行比较，发现对照组女性胆红素比男性低，差异有统计学意义；但肺癌组男女之间差异无统计学意义（表4）。笔者也分析了所检测项目在不同肺癌TNM分组中男女之间差异，结果显示并无统计学意义（P＞0.05，数据未显示）。这说明健康男性胆红素比女性高，这一结果与前期研究一致。但对于肺癌患者来说，正常的胆红素抗氧化平衡被破坏，胆红素水平处于较低水平。

表2 对照组与肺癌组分期胆红素的测定结果Tab.2 The concentrations of bilirubin in controls and patients in different TNMs ±s

表2 对照组与肺癌组分期胆红素的测定结果Tab.2 The concentrations of bilirubin in controls and patients in different TNMs ±s

注：*P为对照组与肺癌患者组各分期均数两两比较

组别对照组T1分期T2分期T3分期T4分期未结合胆红素（μmol/L）10.32±3.00 10.39±3.39 9.99±3.13 9.26±2.66**9.42±2.73*例数422 72 147 95 88总胆红素（μmol/L）12.53±3.59 12.50±4.12 11.89±3.73 11.19±3.41**11.44±3.26**结合胆红素（μmol/L）2.22±0.66 2.17±0.73 2.00±0.67**2.00±0.71**2.02±0.66*

表3 对照组与肺癌组分期胆红素的SOD、MDA测定结果Ta.3 The concentrations of SOD and MDA in controls and patients in different TNMs ±s

表3 对照组与肺癌组分期胆红素的SOD、MDA测定结果Ta.3 The concentrations of SOD and MDA in controls and patients in different TNMs ±s

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

表4 胆红素在不同性别的分布Tab.4 The distribution of bilirubin in different genders ±s

表4 胆红素在不同性别的分布Tab.4 The distribution of bilirubin in different genders ±s

2.4 胆红素与SOD及MDA的相关性分析SOD是细胞内主要的抗氧化系统，而MDA是脂质氧化的产物。通过对胆红素与SOD和MDA的相关性分析，除在对照组中总胆红素和未结合胆红素与SOD有低正相关（r分别为0.377和0.395，P＜0.05），其余的均无显著相关性。具体相关系数见表5。这一结果可能是因为胆红素的抗氧化功能与SOD不一样，胆红素独立发挥抗氧化功能。

表5 胆红素与SOD和MDA的相关性分析Tab.5 The relativity among bilirubin，SOD and MDA

3 讨论

肿瘤细胞过氧化物酶体的过氧化氢酶数量的减少及活性的减弱直接影响了氧化剂的清除，同时也使自由基的生成增加。有研究表明［11］，血清SOD活性测定对判断肿瘤分期及预后具有一定意义，亦是检测肿瘤标志物之一。本研究结果显示，与对照组相比，肺癌患者的SOD活性降低，而MDA含量升高，对照组与TNM分期T1～T4分期肺癌患者SOD活性和MDA含量差异均有显著性，但各分期间无显著性的变化趋势。表明肺癌患者存在着氧化/抗氧化失衡，肺癌肿瘤发生与抗氧化能力的下降有关，这与国内前期研究数据一致［4，12］。

较早前有研究认为与白蛋白结合的胆红素（未结合胆红素）具有较强的氧自由基清除能力［2，13］，近期研究［14］也认为未结合胆红素可以抑制鼻咽癌在肺组织中的转移，提高鼻咽癌的无转移生存率，但它的生物学作用机制并不十分明确［15］。胆红素的抗氧化活性主要在于能清除体内的自由基，胆红素经血红素加氧酶作用后转变为胆绿素，再经还原酶的作用，转变为未结合胆红素，在此还原过程中可提供二个氢原子，起到抗氧化作用。胆红素在正常人体内浓度约为3.4～17.1 μmol/L，比已知的抗氧化剂谷胱甘肽的组织浓度的0.1%还少，它强大的抗氧化作用是通过胆绿素还原酶的接触性扩增作用实现的，占机体总抗氧化能力的30%左右［16-17］。健康人胆红素水平并不很高，可能是因为胆红素作为强抗氧化剂在体内很快被消耗。虽然有关肺癌发生发展与氧化抗氧化的相关性分析研究报道很多，但有关血清胆红素在肺癌的病理过程中的作用研究报道较少。HORSFALL等［5］通过统计英国综合医疗研究数据库中1988-2008年记录的504 206名成人的血清总胆红素数据发现血液中胆红素浓度处于正常但却相对较高范围内的人，其肺癌、慢性阻塞性肺疾病及全因死亡风险会有所下降，其中胆红素浓度增加0.1 mg/dL，男性中的肺癌发病率会减少8%，而女性中的肺癌发病率会降低11%。WEN等［18］的研究也提示在男性吸烟者中，低水平的血清胆红素与高肺癌发生率有相关。笔者对比肺癌患者与健康对照，无论是总胆红素，还是未结合或结合胆红素均有明显下降，两组差异具有显著性。肺癌的发展过程与细胞内的氧化/抗氧化失衡加重有关，本研究中T1～T4分期的肺癌患者胆红素与SOD一样，呈现下降趋势，提示胆红素含量的变化可预测肿瘤的发生与进展。机体大量的SOD、胆红素等抗氧化剂在肿瘤组织集中，以清除肿瘤组织产生的氧化物质，随着肿瘤的恶性增强，机体氧化损伤加剧，脂质过氧化反应终极产物增加，抗氧化剂不足以拮抗氧化产物，从而表现为抗氧化剂活性或含量在肺癌中后期较早期下降。

本研究中，在TNM各分期比较中总胆红素、未结合胆红素呈现逐渐下降的趋势，而结合胆红素未出现此趋势，可能是结合胆红素性质上水溶性强，不易通过生物膜，难与胞内氧自由基作用。另外，它作为白蛋白配基虽然也在血浆中转运，但其结合不如未结合胆红素紧密，抗氧化性相对较弱［19］。笔者认为胆红素在肺癌患者中的抗氧化作用主要由未结合胆红素作用实现。虽然胆红素有抗氧化作用，在肺癌发生过程中可清除逐渐增高的自由基，但研究认为胆红素对白细胞的抗氧化作用时发现在生理条件下高浓度的胆红素才具有抗氧化作用［20］。本研究中，肺癌T1和T2分期的胆红素浓度较T3和T4组的高，但无统计学差异（数据未显示），这可能与标本量有关。

有研究认为胆红素与性别相关［9-10］，男性的外周血循环胆红素比女性高，而随年龄的增长胆红素呈现下降趋势。本研究结果发现，在正常对照组胆红素男性比女性高，与前期研究相符，但肺癌组则两者间差异无显著性，可能是因为癌变发生后，体内的胆红素抗氧化体系被打乱，不能执行正常的功能，均呈现低胆红素水平。

本研究的初步结果显示，正常范围内的胆红素含量与肺癌有一定的相关性，浓度变化与肺癌的进展也相关，高浓度的胆红素可能是通过细胞内抗氧化机制降低肺癌发生的风险［21］。研究表明［22］，对于手术切除非小细胞性肺癌患者，术前胆红素适当升高可以提高总体生存率、无疾病生存率和无转移生存率，同时，结合胆红素可以作为一个对非小细胞性肺癌的手术预后的指标。因本研究是对肺癌患者的小样本调查，其结果可能会受到样本量的影响，还需增加更大的样本量，从而收集得到的数据分析可能会更有说服力。可以建立多中心合作的患者数据库，可以通过大量样本的研究，建立这一疾病的相关模型，当胆红素水平出现有意义的变化时，可提示疾病的发生几率，早发现早治疗，从而提高疾病的痊愈率及治疗后的生活质量。

［1］林青，熊尚全，许少锋，等.胆红素及氧化修饰低密度脂蛋白与冠心病的关系［J］.临床心血管病杂志，2002，18（5）：204-206.

［2］STOCKER R，YAMAMOTO Y，MCDONAGH A F，et al.Bilirubin is an antioxidant of possible physiological importance［J］.Science，1987，235（4792）：1043-1046.

［3］HAN S，YANG J D，DINN D H，et al.Higher bilirubin levels of healthy living liver donors are associated with lower posttransplant hepatocellular carcinoma recurrence［J］.Transplantation，2016，100（9）：1993-1938.

［4］操敏，李琦，张宗德，等.肺癌组织中抗氧化酶及氧化代谢产物变化的定量分析［J］.中国肺癌杂志，2009，12（4）：322-326.

［5］HORSFALL L J，RAIT G R，WALTERS K，et al.Serum bilirubin and risk of respiratory disease and death［J］.JAMA，2011，305（7）：691-697.

［6］LIM J E，KIMM H，JEE S H.Combined effects of smoking and bilirubin levels on the risk of lung cancer in Korea：the severance cohort study［J］.PLoS One，2014，9（8）：e103972.

［7］ZHANG Y W，XU J L，LOU Y Q，et al.Pretreatment direct bilirubin and total cholesterol are significant predictors of overall survival in advanced non-small-cell lung cancer patients with EGFR mutations［J］.Int J Cancer，2017，140（7）：1645-1652.

［8］DETTERBECK F C，BOFFA D J，TANOUE L T.The New Lung Cancer Staging System［J］.Chest，2009，136（1）：260-271.

［9］霍雯，杨岚，刘宇，等.血清总胆红素、直接胆红素、间接胆红素生物参考区间的建立［J］.国际检验医学杂志，2017，38（3）：391-392.

［10］孟凡飞，蒲晓允.重庆地区健康人群总胆红素和直接胆红素参考范围的调查［J］.检验医学与临床，2015，22：3397-3339.

［11］唐煦，周国林.关于血清Cu、Zn及CuZn-SOD与恶性肿瘤关系的探讨［J］.微生物学免疫学进展，1997，25（2）：35-37.

［12］孙昕，王义高.超氧化物歧化酶、丙二醛和细胞因子在肺肿瘤患者的表达［J］.现代肿瘤医学，2009，17（11）：2120-2122.

［13］STOCKER R，GLAZER A N，AMES B N.Antioxidant activity of albumin-bound bilirubin［J］.Proc Natl Acad SCI，1987，84（16）：5918-5922.

［14］DENG C C，XU M，LI J，et al.Unconjugated Bilirubin Is a Novel Prognostic Biomarker for Nasopharyngeal Carcinoma and Inhibits Its Metastasis via Antioxidation Activity［J］.Cancer Prev Res，2016，9（2）：180-188.

［15］GAZZIN S，VITEK L，WATCHKO J，et al.A Novel Perspective on the Biology of Bilirubin in Health and Disease［J］.Trends Mol Med，2016，22（9）：758-768.

［16］杨俊娟，程宇彤，张钧华.胆红素和氧自由基与心血管疾病的关系［J］.中国动脉硬化杂志，2006，14（8）：728-730.

［17］BARANANO D E，RAO M，FERRIS C D，et al.Biliverdin reductase：a major physiologic cytoprotectant［J］.Proc Natl Acad Sci，2002，99（25）：16093-16098.

［18］WEN C P，ZHANG F，LIANG D，et al.The ability of bilirubin in identifying smokers with higher risk of lung cancer：a large cohort study in conjunction with global metabolomic profiling［J］.Clin Cancer Res，2015，21（1）：193-200.

［19］FLORCSZYK U M，JOZKOWICZ A，DULAK J.Biliverdin reductase：new features of an old enzyme and its potential therapeutic significance［J］.Pharmacol Rep，2008，60（1）：38-48.

［20］YESILKAYA A，ALTINAYAK R，KORQUN D K.The antioxidant effect of free bilirubin on cumene hydroperoxide treated human leukocytes［J］.Gen l Pharmacol，2000，35（1）：17-20.

［21］BOLAND B S，DONG M H，BETTENCOURT R，et al.Association of Serum Bilirubin with Aging and Mortality［J］.J Clin Exp Hepatol，2014，4（1）：1-7.

［22］LI N，XU M，CAI M Y，et al.Elevated serum bilirubin levels are associated with improved survival in patients with curatively resected non-small-cell lung cancer［J］.Cancer Epidemiol ，2015，39（5）：763–768.