C57BL/6小鼠尾静脉四种穿刺方法的比较

温军业，范晓燕，何东伟，张万星，黄书静，张宇龙(.河北省人民医院普外三科，石家庄 050000； 2.河北省人民医院肿瘤科，石家庄 050000； .河北医科大学第四医院，石家庄 050000； .石家庄市第一医院外三科，石家庄 050000)

动物模型中常用到小鼠，特别是C57BL/6小鼠，是肿瘤学、生理学、免疫学、遗传学等研究中常用的品系。小鼠通过尾静脉采血、给药等是免疫学小鼠动物实验中的常用操作技术，因此尾静脉穿刺的成功与否直接决定着实验能否顺利进行[1]。不同于白色小鼠，C57BL/6小鼠因其体表为黑色，故常规实验条件下其尾静脉观察存在一定的难度。该品系小鼠尾部共有3根静脉，分别为背侧静脉、左侧和右侧外周静脉。一般选择左侧或右侧外周静脉进行穿刺取血，所以实验是否能够达到预期疗效，取决于鼠尾静脉注射给药是否成功。基于以前有人研究水浴浸泡法、酒精擦拭法、白炽灯烘烤法，但并未研究三头线法及联合法的成功率，本实验将尝试通过比较小鼠尾静脉的四种不同注射方法，为研究者选择合适的尾静脉穿刺方法提供成功率更高的实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级C57BL/6小鼠320只，6～8周龄，雌雄不限，体重约18～20 g，购自河北省实验动物中心[SCXK (冀) 2013-0051]，饲养于河北省实验动物中心(SPF级动物实验室)[SYXK (冀) 2013-1-003]。

1.2 主要试剂与仪器

0.9%生理盐水(石家庄四药有限公司)，75%酒精(邯郸市捷利康商贸有限公司)，纯净水(河北医科大学第四医院提供)。

一次性使用无菌胰岛素注射器若干(江苏万邦生化医药股份有限公司，注册标准YZB/USA 0355-2011)，1号、7号手术缝合线若干(河北省人民医院手术室提供)，棉签(新乡市华西卫材有限公司)，超薄刀片(上海飞鹰刀片厂)，白炽灯(南皮亚明灯泡制造有限公司)。此外，还需自制小鼠固定器若干套进行动物的固定：自制小鼠固定器为50 mL塑料离心管，管盖中心处打一圆形小孔，仅容尾巴露出。将小鼠放入自制小鼠固定器内，因小鼠较小，50 mL离心管相对活动空间较大，所以在离心管前方中上2/3处划一道缝，可用硬卡片或者废旧银行卡堵于此处，以防止小鼠向前自由行走。此外，管壁上打少许小孔，以防小鼠窒息。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物分组

将320只小鼠随机分成四组：空白组、白炽灯烘烤法组、三头线法组、联合应用法组，每组80只。

1.3.2 各组穿刺前预处理

(1)空白组：将小鼠放入自制固定器内，仅尾巴露出，无需任何特殊处理，固定好直接穿刺。见图1A。

(2)白炽灯烘烤法组：将小鼠固定于自制固定器内，尾巴露出，用白炽灯照射小鼠尾部，同时用适当压力按摩小鼠尾部。为避免加热温度过高及对小鼠身体进行照射，以遮挡物遮挡小鼠身体，减少刺激，以防止引起小鼠血液激素水平的改变，从而影响实验结果。照射时间一般为8～10 min，照射结束后移去白炽灯，即可进行穿刺。见图1B。

(3)三头线法组：将小鼠固定于自制固定器内，仅尾巴露出，用7号缝合线于1号缝合线上打一外科结，再用1号缝线在7号缝线上打一外科结，形成固定十字交叉，剪断1号线两头其中的一根，形成三头线。先用7号缝合线在鼠尾根部打一活结，阻断根部静脉，扩张了背部静脉血管，注射成功后由另一协助者协助向上提拉1号线，使结松开，避免了单根缝合线打结后解结的繁琐程序，固定好即可穿刺。见图1C。

(4)联合应用法：将小鼠固定于自制固定器内，固定好小鼠，用白炽灯照射小鼠尾部，同样以遮挡物遮挡小鼠身体部位，照射小鼠尾部时间一般为8～10 min，然后立即用三头线在鼠尾静脉根部结扎，不要太紧，迅速用酒精棉球在鼠尾静脉擦拭2～3遍，用左手拇指和食指捏住鼠尾下1/3处，撑直尾巴，切不可用力过大，以防尾巴撑断，以适当力使尾巴固定穿刺即可。当注射器穿入鼠尾静脉后，这时可以让协助者向上提拉1号线，松开结。见图1D。

1.3.3 尾静脉穿刺操作及成功标准

鼠尾左侧或右侧静脉中1/3到下1/3，皮下组织相对较少，静脉比较浅表，是穿刺取血的较好部位。本实验由同一个操作者进行穿刺，另一个人协助操作。操作进行一段时间后，视体力情况稍事休息再继续进行实验。操作者用左手拇指和食指捏住鼠尾下1/3处，撑直尾巴，切不可用力过大，以防尾巴撑断，以适当力使尾巴固定即可，中指顶于固定器尾盖处，固定小鼠尾巴，防止摆动，右手持注射器，针尖斜面向上，以约10°角穿入小鼠尾静脉，针尖约长2 mm，当针尖刺入约一半时，可以近乎平行的角度缓慢进针，进针3～5 mm，试推少许生理盐水，若注射不通畅，则表明未在血管内，若血管变白，无阻力，表明在血管内，每只小鼠穿刺时间小于2 min。注射完毕后拔出针尖，并以棉签压迫穿刺点，3 d后观察鼠尾是否出现局部肿胀、溃疡及坏死现象，来判断穿刺是否成功。所有实验操作程序均经过河北省人民医院实验动物中心批准，并按照实验动物使用的3R原则给予特定的人道主义关怀。

1.4 统计学方法

实验结果用SPSS 13.0统计软件进行分析。计数资料用卡方检验，以P< 0.05为差异有显著性。多个样本间多重比较用χ2分割法比较，比较α=0.05/(4×3/2×1) ≈ 0.008，以P< 0.008为差异有显著性。

2 结果

四种方法鼠尾静脉穿刺成功率如表1所示。通过组间两两比较可见：白炽灯烘烤法效果强于空白对照组(χ2=40.172，P< 0.001)；三头线法较空白对照组、白炽灯烘烤法而言，穿刺成功率明显提高(χ2=85.066，P< 0.001；χ2=12.745，P< 0.001)；与空白对照组、白炽灯烘烤法或三头线法相比，联合应用法提高了穿刺效率，且差异有显著性(χ2=129.681，P< 0.001；χ2=41.243，P< 0.001；χ2=10.667，P=0.001)。此外，在穿刺过程中，白炽灯烘烤法组有1只因注射速度较快，出现心衰导致死亡，记为无效。

注：A：空白组；B：白炽灯烘烤法组；C：三头线法组；D：联合应用法组。图1 各组操作示意图Note.A: Blank group; B: Incandescent lamp baking method group; C: Three-line method group; D: Combined method group.Fig.1 Different devices used in four groups

表1 四种方法的穿刺成功率Tab.1 Puncture success rate of the four methods

3 讨论

小鼠尾静脉穿刺是采血、注射给药等小鼠模型实验的关键技术，联合应用法成功率较其他三种方法静脉注射成功率高，原因主要是不仅综合了白炽灯烘烤法，而且采用三头线阻断根部静脉回流，且注射后连续观察3 d均未出现局部肿胀及坏死现象，大大提高了注射成功率。单用静脉阻断会降低其穿刺成功率，白炽灯烘烤法延长了静脉扩张时间，方便操作者更好地注射，为其提供了更充分的时间，三头线静脉阻断则是明显扩张背部静脉血管，避免了单根缝合线打结后解结的繁琐程序，固定好即可穿刺，也避免注射针穿刺成功后解结所带来的摆动性，避免穿刺失败。李轶倞等[2]报道的笼盖压制法对于需多次重复的尾静脉注射实验不太适宜。另外需要注意的是：①注射时应注意注射速度，相关研究表明[3 - 4]，成年小鼠血循环的总容量约1.4 mL，鼠尾静脉直径平均小于(0.6±0.5) mm，每次注射的剂量不应超过0.2 mL，防止小鼠心衰；如果一旦出现小鼠心衰情况，立即停止注射，对小鼠实行心脏按摩。②因鼠尾静脉血管管壁较薄，针头进入及注射药物时，手不要发抖，防止扎穿。③应先从鼠尾中下部位注射，若第一次失败，可逐渐沿鼠尾静脉走行向上进行穿刺。④穿刺过程中应手稳、心静。⑤可先用超薄刀片将小鼠鼠尾背部两侧静脉走行区尾毛蜕干净，在蜕毛过程中，应从鼠尾根部以20°角自上向下蜕毛，切忌用劲过大，削破鼠尾，一般蜕毛应两遍，可使穿刺视野更加清楚，提高穿刺成功率。⑥穿刺完毕后，应用棉签压迫止血，对于连续多次、多日的鼠尾静脉注射，需注意尾部的消毒，防止感染。良好彻底的止血对于保护血管是非常重要的。⑦本实验在注射时拇指、食指、中指的姿势依据个人习惯，熟练掌握以后，也可一人操作完成，因数量较多，两人操作较快，效率较高。⑧为避免人为刺激引起小鼠血液激素水平的改变，应避免加热温度过高[5]，还应保持实验室内温度在28℃左右，特别是冬季很有必要，因为适宜的室内温度对小鼠尾静脉也有一定的扩张作用，并且能够使血流通畅，降低注射阻力。目前C57BL/6小鼠尾静脉注射不同方法报道文献较少，本实验通过对比研究，得出联合应用法穿刺成功率高，值得推广。

参考文献：

[1] 李富荣, 王新根, 邓春艳, 等. 间充质干细胞联合胰岛移植对受体鼠T淋巴细胞亚群的影响 [J]. 免疫学杂志, 2010, 26(7): 606-611.

[2] 李轶倞, 张娜, 田枫. 一种简易小鼠尾静脉注射固定法——笼盖压制法 [J]. 中国比较医学杂志, 2016, 26(10): 79-81.

[3] 余绍兰, 马跃荣. 实验用小鼠尾静脉穿刺的几点体会 [J]. 泸州医学院学报, 2007, 30(4): 330.

[4] 苏丽娜, 郭剑伟, 饶光玲. 小鼠尾静脉注射与断头取血实验技术的改进 [J]. 大理学院学报, 2010, 9(6): 25-27.

[5] 施文, 孙永强. 小鼠尾静脉注射和采血简易固定装置的制作和使用方法 [J]. 免疫学杂志, 2011, 27(9): 807-808.