氯硝柳胺乙醇胺盐对大鼠冠状动脉的舒张作用及机制研究

宋奇颖，郭鹏美，董丽娜，董苗苗，刘 宇(山西医科大学药理学教研室，太原 030001)

氯硝柳胺乙醇胺盐(niclosamide ethanolamine，NEN)是氯硝柳胺的盐形式，具有抗血吸虫作用，是目前国内控制血吸虫媒介螺蛳的首选药物[1]。NEN具有线粒体氧化磷酸化解偶联作用，可通过抑制细胞分裂周期37蛋白，阻断多种信号通路，减缓肝癌细胞的生长[2]。NEN增高糖尿病大鼠AMP激活的蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平而减轻肝脏脂肪变性，降低胰岛素抵抗，减缓糖尿病进程[3]。最近研究表明，NEN对大鼠肠系膜动脉和主动脉具有舒张作用[4]。了解NEN对冠状动脉的作用及其机制对其进一步应用具有重要意义。本研究采用离体微血管张力测定法探讨NEN对大鼠冠状动脉(rat coronary artery，RCA)肌张力的影响及其作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠32只，8周龄，体重为220～250 g，购自山西医科大学实验动物中心[SCXK (晋) 2015-001]。受试动物饲养于山西医科大学SPF级动物房[SYXK (晋) 2015-001]，温度为22℃～25℃，湿度为50%～70%，光照12 h，期间自由饮食饮水。动物实验操作均按照实验动物使用的3R原则给予人道主义关怀，符合本校动物实验伦理学标准，符合国家《实验动物管理条例》。

1.2 主要试剂与仪器

血栓素A2受体激动药(U46619)、4-氨基吡啶(4-AP)、氯化钡(BaCl2)、四乙胺(TEA)、格列本脲(Gli)、PD98059、SB239063、HEPES、EGTA均购自美国Sigma公司，NEN购自上海江莱生物科技有限公司，其余为市售分析纯。正常生理盐溶液(PSS溶液)成分为：NaCl(118 mmol/L)，KCl(4.7 mmol/L)，CaCl2(2.5 mmol/L)，KH2PO4(1.2 mmol/L)，NaHCO3(25 mmol/L)，MgSO4(1.2 mmol/L)，HEPES(5 mmol/L)，葡萄糖(11 mmol/L)。NEN、PD98059、SB239063用DMSO溶解，加药时保证浴槽中DMSO终浓度不超过1%。文中所述浓度均为各试剂在浴槽PSS溶液中的终浓度。

Multi Myograph System-610M微血管张力记录系统购自丹麦DMT公司，PowerLab生物信号采集分析系统购自澳大利亚埃德仪器国际贸易有限公司，Nikon解剖显微镜购自日本Olympus公司，Sartorius BS124S精密天平购自北京赛多利斯科学仪器有限公司，Heal Force新一代超纯水仪购自新仪器(上海)有限公司，PHS-3C精密pH计购自上海精科实业有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 离体RCA血管环标本的制备

大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉处死后，立刻取出心脏，置于盛有4℃、pH 7.4且用95% O2+ 5% CO2混合气体饱和的PSS溶液中。将心脏置于显微镜下仔细分离大鼠RCA前降支，剪取直径为200～240 μm、长度约为2 mm的血管环，用两根直径为40 μm的细钢丝通过管腔将其固定于DMT浴槽内张力换能器上，Chart 7.3生物信号采集软件记录其张力变化。槽内盛有37℃、pH 7.4、95% O2+ 5% CO2混合气体饱和PSS溶液5 mL。RCA在浴槽内平衡稳定1 h，期间每隔15 min更换一次预热(37℃)的新鲜PSS溶液。在正式实验开始前，用KCl(60 mmol/L)刺激RCA收缩，重复3次，若连续两次RCA收缩幅度差别小于10%，且最大收缩幅度大于2 mN，认为该血管环的活性良好，肌源性功能正常，稳定30 min后开始正式实验。血管环详细制备过程及活性检测参照课题组已发表文献[5]。

1.3.2 NEN对离体RCA的舒张作用

RCA稳定30 min后，分别加入KCl(60 mmol/L)、U46619(0.3 μmol/L)，当收缩达到坪台后，向浴槽内累积加入NEN，使其终浓度依次为0.5、1、1.5、2、2.5、3 μmol/L，每次加药需待前一个药物浓度作用达到坪台后再加下一个浓度，记录RCA张力的变化。对照组则依次加入相应体积的溶剂(DMSO)以观察溶剂对RCA张力的影响。以收缩剂引起RCA收缩的最大幅度为100%，计算不同浓度NEN的舒张百分比、最大舒张率和舒张50%时所需的药物浓度(RC50值)。

1.3.3 相关抑制剂对NEN舒张RCA作用的影响

用U46619(0.3 μmol/L)刺激RCA收缩，待其收缩达到坪台后，在抑制剂不存在(对照)和抑制剂预孵并存在情况下分别记录NEN的舒张作用。在加入NEN之前10 min分别加入Kv阻断剂4-AP(1 mmol/L)、Kir阻断剂BaCl2(1 mmol/L)、KCa阻断剂TEA(1 mmol/L)、KATP阻断剂Gli(0.01 mmol/L)、MAPK抑制剂PD98059(3 μmol/L)或SB239063(3 μmol/L)，待RCA收缩再次达到坪台后加入NEN(2 μmol/L)，观察抑制剂对NEN舒张RCA作用的影响。以最大收缩幅度为100%，计算NEN的舒张百分比。

注：A、B：分别为NEN舒张KCl或U46619引起大鼠RCA收缩的原始记录图；C、D：NEN浓度-舒张曲线。与溶剂对照组相比，* P < 0.05。图1 NEN对KCl、U46619预收缩的RCA的舒张作用Note.A and B: Typical original tracing after application of KCl or U46619 followed by cumulative application of niclosamide ethanolamine, respectively. C and D: Relaxation was expressed as percentages of maximal contraction induced by KCl (60 mmol/L) or U46619 (0.3 μmol/L), respectively. Compared with the vehicle control group,*P< 0.05.Fig.1 Niclosamide ethanolamine-induced relaxation in rat coronary artery precontracted with KCl or U46619

1.3.4 NEN对收缩剂所致的细胞内或外钙依赖性收缩的影响

用含EGTA(1 mmol/L)的无钙PSS溶液洗脱RCA，15 min后将浴槽内的液体更换为不含EGTA的无钙PSS溶液[5]。继续平衡15 min后将液体更换为等体积的无钙60 mmol/L高钾PSS溶液或直接加入U46619(0.3 μmol/L)，待收缩达到坪台后复钙，即加入CaCl2使浴槽中Ca2+为2.5 mmol/L，血管继续收缩达到坪台后用正常PSS溶液洗脱。待RCA恢复静息张力后分别用NEN(1、1.5、2 μmol/L)预孵15 min，然后在NEN存在的情况下重复以上去钙和复钙操作。观察不同浓度NEN对外钙内流和内钙释放引起的RCA收缩的影响。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 NEN浓度依赖性舒张离体大鼠RCA

KCl(60 mmol/L)、U46619(0.3 μmol/L)收缩离体大鼠RCA，最大收缩幅度分别为(4.04±0.26) mN、(3.75±0.69) mN；NEN(0.5～3 μmol/L)浓度依赖性地舒张KCl和U46619收缩的离体RCA，其最大舒张百分率分别为(93.97±0.85)%、(91.06±1.23)%，RC50分别为(1.85±0.28) μmol/L、(1.94±0.41) μmol/L。见图1。

2.2 钾通道阻断剂和MAPK抑制剂对NEN舒张大鼠RCA作用的影响

NEN(2 μmol/L)对U46619(0.3 μmol/L)预收缩RCA的最大舒张百分率为(62.85±4.07)%。在钾通道阻断剂4-AP(1 mmol/L)、BaCl2(1 mmol/L)、TEA(1 mmol/L)、Gli(0.01 mmol/L)存在情况下，NEN的最大舒张百分率分别为(57.88±5.98)%、(54.69±4.62)%、(55.56±3.97)%和(57.51±3.61)%，与对照组相比均无显著影响(P> 0.05，见图2)。MAPK抑制剂PD98059(3 μmol/L)、SB239063(3 μmol/L)存在时，NEN(2 μmol/L)对KCl(60 mmol/L)预收缩RCA的舒张幅度分别减小(27.93±0.71)%和(30.47±0.82)%(P< 0.05)；对U46619(0.3 μmol/L)预收缩RCA的舒张幅度分别减小(25.92±0.58)%、(27.09±0.65)%，差异有显著性(P< 0.05，见图3)。

图2 钾通道阻断剂对NEN舒张U46619预收缩RCA作用的影响Fig.2 Effect of K+ channel inhibitors on niclosamide ethanolamine-induced relaxation in isolated rat coronary artery rings precontracted with 0.3 μmol/L U46619

注：与NEN相比，* P< 0.05。图3 MAPK抑制剂对NEN舒张RCA作用的影响Note.Compared with NEN,*P< 0.05.Fig.3 Effect of mitogen-activated protein kinase inhibitors on niclosamide ethanolamine-induced relaxation in isolated rat coronary artery rings precontracted with 60 mmol/L KCl or 0.3 μmol/L U46619

2.3 NEN对细胞内钙释放和细胞外钙内流所致收缩的影响

KCl(60 mmol/L)在无钙PSS溶液中引起RCA收缩幅度为(0.11±0.13) mN，复钙后收缩幅度为(3.92±1.13) mN。预孵NEN(1、1.5、2 μmol/L)能明显抑制KCl(60 mmol/L)外钙内流引起的RCA收缩(见图4)，收缩幅度分别为(3.73±1.02) mN、(2.35±0.61) mN、(1.60±0.25) mN。U46619(0.3 μmol/L)在无钙PSS溶液中引起RCA收缩幅度为(0.55±0.14) mN，复钙后进一步收缩RCA，其收缩幅度为(3.44±1.13) mN。预孵NEN(1、1.5、2 μmol/L)能明显抑制U46619(0.3 μmol/L)复钙后外钙内流引起的RCA收缩，收缩幅度分别为(3.28±0.95) mN、(2.34±0.16) mN、(1.71±0.23) mN，差异有显著性(P< 0.05，见图5)；而NEN对内钙释放引起的收缩均无明显影响(P> 0.05，见图4、图5)。

注：与NEN 0 μmol/L相比，* P< 0.05。图4 NEN对KCl引起的细胞内钙依赖性和细胞外钙依赖性RCA收缩的影响Note.Compared with vehicle control (NEN 0 μmol/L),*P< 0.05.Fig.4 Effect of niclosamide ethanolamine on rat coronary artery contraction induced by KCl in a Ca2+-free bath followed by restoration of 2.5 mmol/L Ca2+

注：与NEN 0 μmol/L相比，* P< 0.05。图5 NEN对U46619引起的细胞内钙依赖性和细胞外钙依赖性RCA收缩的影响Note.Compared with vehicle control (NEN 0 μmol/L),*P< 0.05.Fig.5 Effect of niclosamide ethanolamine on rat coronary artery contraction induced by U46619 in Ca2+-free PSS followed by restoration of 2.5 mmol/L Ca2+

3 讨论

氯硝柳胺是世界卫生组织唯一推荐使用的杀灭血吸虫中间宿主的杀螺剂，其机制为对寄生虫的线粒体氧化磷酸化具有解偶联作用。另有研究发现氯硝柳胺具有抗结核、抗病毒、抗肿瘤以及改善糖尿病抵抗等作用[6 - 8]。氯硝柳胺水溶性低的特点限制了其应用。NEN是氯硝柳胺合盐，具有更高的水溶性，同时具有对哺乳动物毒性低和对环境污染小等优点。最近研究表明，NEN对大鼠肠系膜动脉和主动脉具有显著的舒张作用，其机制可能与激活AMPK有关[4]。冠状动脉形成起源、生物学特点及药理学特点均不同于其他血管[9 - 10]，了解药物对冠状动脉的影响对临床合理用药具有重要意义。本研究表明，NEN对处于收缩状态的RCA具有强大的舒张作用，最大舒张率可达90%以上，RC50< 2.0 μmol/L。其药理学特点为舒张RCA浓度范围相对较窄(0.5～3 μmol/L)，对去极化(60 mmol/L KCl)和血栓素A2受体激动药所致收缩的舒张作用无明显的选择性。

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)上主要表达有Kv、Kir、KCa和KATP四种钾通道，它们在VSMC细胞膜电位和血管阻力的调节中具有重要作用[11 - 13]。该四种钾通道选择性抑制剂分别为4-氨基吡啶、氯化钡、四乙胺和格列本脲，本研究结果表明，它们对NEN舒张U46619预收缩的RCA均无显著影响，提示NEN对离体大鼠RCA的舒张作用与钾通道无关。MAPK在VSMC收缩中起重要作用[14]。本实验结果显示MAPK抑制剂PD98059和SB239063减弱NEN的舒张作用，提示NEN舒张RCA可能与其激活MAPK有关。本研究结果还表明，NEN选择性抑制细胞外钙依赖性收缩成分，其抑制程度与其舒张RCA强度相一致，而对血管收缩剂所致的细胞内钙释放依赖性的收缩成分无显著影响，这可能与其脱偶联作用促进线粒体Ca2+释放有关[4]。

综上所述，本研究证明NEN对RCA具有突出的舒张作用，并提示该作用可能与其激活MAPK信号通路、抑制细胞外钙内流有关。本研究扩展了对NEN血管作用的认识，为临床合理评估NEN对冠状动脉的作用提供基础研究参考。

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