食品级二氧化钛的口服安全性评估

□ 张天宇 谢志雄 武汉大学生命科学学院

1 前言

二氧化钛具有高亮度、高折射率、良好的抗污性、耐光性等特性，被广泛用作食品添加剂和色素[1]，二氧化钛是符合我国GB2760-2014《食品添加剂使用标准》规定的食品添加剂，其最大添加剂量可达1%[2]。

最近在体外实验中发现，食品级二氧化钛会在小肠上皮细胞表面聚沉，并且会导致小肠绒毛结构损伤，引起炎症反应，导致小肠吸收效率降低[3-4]；体内实验中，一次性口服100 mg食品级二氧化钛后，利用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析发现，2 h后二氧化钛会进入血液循环系统并在6 h达到峰值[5]，进入血液循环系统中的二氧化钛颗粒会聚集在许多器官中，由于肝脏和肾脏是重要的解毒和代谢器官，二氧化钛颗粒在两个部位的聚集尤其突出，推测这些二氧化钛可能会造成肝、肾功能损伤[6]。但是，这些研究的实验体系并不符合日常生活中食品级二氧化钛的摄入方式。

为了更好探究日常生活中口服摄入的食品级二氧化钛（最高添加剂量1%）是否会对肝肾功能、小肠结构和吸收效率等产生影响，采用大鼠模型连续四周以每两天灌胃喂食食品级二氧化钛颗粒溶液1 000 mg/kg体重/次的频率进行了探究。

2 材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 二氧化钛

食品级二氧化钛（GB25577-2010），购自上海江沪钛白化工制品有限公司。

2.1.2 大鼠

SPF级Sprague-Dawley（SD）大鼠购于自湖北省疾病预防控制中心。大鼠均为雄性，6周龄，体重230±6 g。

2.1.3 试剂和溶液

组织固定液：购于武汉赛维尔生物技术有限公司。

木糖检测试剂盒：购于南京信帆生物技术有限公司。

2.2 实验方法与步骤

2.2.1 大鼠的饲养和灌胃处理

大鼠自湖北省疾病控制中心买回后，饲养在武汉大学生命科学学院SPF级动物房中，实验开始前十天为大鼠适应动物房生活时期。动物房光照条件为12 h黑暗、12 h光照，食物和水均可自由获得。大鼠均为1只/笼，以排除大鼠间的相互影响。

实验开始后，将大鼠按6只/组随机分为实验组和对照组，实验组大鼠以每两天一次的频率灌胃喂食1 000 mg/kg体重的二氧化钛，对照组以相同频率灌胃喂食相同体积的无菌水，连续灌胃处理四周。

2.2.2 肝肾功能指标的获取

灌胃四周后，对大鼠进行麻醉处理，通过颈动脉取血1 mL后3 000 rpm离心10 min，取血清利用血液生化分析仪进行生化指标的测量。

2.2.3 小肠吸收效率的测评

以D-木糖吸收效率评估小肠吸收效率，方法如下：灌胃四周后，禁食大鼠12 h，灌胃喂食0.8 g/kg体重D-木糖；2 h后麻醉大鼠，通过颈动脉取血1 mL后3 000 rpm离心10 min，取血清；然后利用D-木糖检测试剂盒测量血清中D-木糖的含量；最后，用血清中的D-木糖含量评估实验组与对照组大鼠小肠的吸收效率。

2.2.4 小肠生理切片的制备

灌胃四周后，将大鼠进行麻醉处理，取小肠后浸于组织固定液24 h。固定完成后，委托武汉赛维尔生物技术有限公司进行石蜡包埋和切片的制备。

2.2.5 食物、水消耗量和体重增长的统计

在灌胃期间，每两天测量一次食物消耗量、饮水量和体重数据。

2.2.6 结果的统计与分析

对照组和实验组中大鼠数量均≥3，实验结果数值代表平均值±标准误差。显著性分析利用SigmaPlot 12.5的T检验进行。

3 结果与分析

3.1 口服二氧化钛对肝、肾功能的影响

血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶（ALP）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）和球蛋白（GLOB）的含量一般作为肝功能检测的主要指标，肝脏被损伤时，血清中的ALT和AST含量会升高，而ALB含量会降低[7]；血清中尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）、尿酸（UA）的含量以及尿素氮与肌酐的比值（BUN/CREA）一般作为肾功能检测的主要指标，肾脏被损伤时，血清中的BUN、CREA和UA含量会增加[8]。

图1 灌胃四周后对照组与实验组大鼠的肝脏、肾脏功能指标

通过对大鼠血清中相关生化指标的分析，发现实验组大鼠肝脏和肾脏功能指标均与对照组大鼠没有产生显著性差异（如图1所示）。结果表明，持续四周每两天灌胃一次1 000 mg/kg体重食品级二氧化钛不会对大鼠肝、肾脏功能造成显著影响。

3.2 口服二氧化钛对小肠结构和功能的影响

利用小肠生理切片和D-木糖的吸收实验评估了二氧化钛对小肠生理结构与功能产生的影响[9]。通过对小肠切片的观察和分析发现灌胃喂食四周后，大鼠小肠上皮和绒毛结构完整，没有出现炎症反应，上皮细胞也没有出现明显的坏死、脱落现象（如图2所示）。

D-木糖的吸收实验表明，连续四周的灌胃喂食食品级二氧化钛并没有对小肠的吸收功能造成显著性的影响（如图3所示）。

3.3 口服二氧化钛对体重增长的影响

通过对四周内大鼠食物消耗量和饮水量的统计与分析发现，实验组大鼠与对照组大鼠在饮水和食量上并没有显著差异，表明食品级二氧化钛并没有导致大鼠厌食或者暴饮暴食，大鼠的体重增长速度也表明，灌胃喂食二氧化钛并没有对大鼠的体重增长产生影响（如图4所示）。

图2 灌胃四周后对照组与实验组大鼠的小肠生理切片

图3 D-木糖吸收实验

4 讨论

图4 对照组和实验组大鼠在灌胃处理四周内的饮水量和食用食物量（左）和体重增长（右）

随着公众对健康饮食关注度的提升，食品级二氧化钛作为食品添加剂和色素的潜在影响引起了广泛的关注。以往对二氧化钛食品添加剂安全性评估的研究多是通过静脉、腹膜注射或者体外实验体系进行。但是，在日常生活中，我们摄入体内的食品级二氧化钛绝大部分是通过口服途径，所以，以往研究的实验体系并不能很好评估二氧化钛食品添加剂的生物安全性。本实验利用灌胃喂食大鼠食品级二氧化钛进行评估的体系和模型，使实验条件更贴近生活中的自然状态，相较于之前研究中的实验体系，评估方式更合理，实验数据更能反映实际情况，更适合评估食品级二氧化钛生物安全性。

在以往体外实验中，小肠绒毛结构直接浸泡于含有二氧化钛的培养基中，二氧化钛会由于重力作用聚集在小肠绒毛表面，损伤小肠绒毛结构和功能[4]，而在日常生活中，由于肠胃的蠕动、肠道上皮细胞死亡、再生和肠道粘膜的屏障作用，口服进入肠道的二氧化钛对小肠绒毛生理结构和功能的影响会减弱，所以，我们的实验体系更贴近生活中的实际情况；在体内实验中，通过静脉等途径注射的二氧化钛会直接进入血液循环系统，聚集在诸多器官中[10]，影响器官功能[6]，而实际生活中进入血液循环系统和器官中的二氧化钛总量较少，本实验建立的模型更贴近日常状态下的积累量。

本实验通过建立比之前相关研究中更合理的评估体系，发现持续四周口服摄入含有1%食品级二氧化钛食物添加剂的食物不会造成大鼠小肠绒毛结构和肝、肾功能损伤，表明国家规定的食物中最高1%的食品级二氧化钛食物添加剂量属于安全剂量。本文对合理评估食品级二氧化钛应用的安全性具有重要的参考价值，为食品级二氧化钛食物添加剂安全使用剂量提供了依据。

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