Lynch综合征相关结直肠癌的遗传基因及分子病理筛查策略

王雯邈 董林 李文斌 邹霜梅 吕宁

一、前言

Lynch 综合征，旧称遗传性非息肉病性结直肠癌（hereditary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC），是一种常染色体显性遗传综合征。正常人患结直肠癌的风险是5～6%，而Lynch综合征人群则升高至70～80%，占所有大肠癌的2～3%［1］。此外，该综合征同时增加了罹患胃、子宫内膜和卵巢恶性肿瘤的风险，而泌尿系、肝胆道及胰腺恶性肿瘤风险则相对较低。因此，提高Lynch综合征的筛检率，进而加强对该类人群的监测和随访可有效降低结直肠癌的发病率及死亡率。

二、遗传学基础

Lynch综合征是由于编码错配修复基因（mismatch repair，MMR）的种系突变、失活导致的遗传性疾病［1］。现已阐明，人类MMR基因编码的错配修复蛋白可相互作用形成一种多聚复合物，参与细胞错配修复反应。错配修复反应既可以修复DNA复制过程中出现的碱基错配，可以消除由于含简单重复序列的同源序列之间的遗传重组出现的不配对碱基序列，这样可有效防止DNA复制差错的发生，MMR系统在识别和修复DNA复制过程中出现的错配碱基，维持细胞DNA中微卫星乃至整个基因组的稳定方面发挥重要作用。MMR基因在人类多达12个，但目前已知与Lynch综合征的发生明确有关的有4个，分别是MSH2，MLH1，MSH6 和 PMS2［2］。其中 70～85% 的 Lynch综合征与MLH1或MSH2的突变有关，其产生的肿瘤大多为结直肠癌，而MSH6突变约占14%，其突变者中子宫内膜癌的患病率明显高于其他基因突变者［3-4］。

此外，作为错配修复系统的一部分，MLH3和Exo140与Lynch综合征的相关性研究进展仍然值得期待［5］。

微卫星是由2～6个核苷酸组成的具有高度多态性的简单串联重复序列，在不同个体间各不相同，而在同一个体的不同组织中保持一致。微卫星广泛分布于整个基因组序列中，常见的有核苷酸重复序列，尤以二核苷酸的重复序列最为常见。微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）是指微卫星序列中重复单位的增加或减少，是发生在核苷酸水平的不稳定现象［1］。大量研究表明，MMR系统功能缺失可导致MSI显著增加，从而导致肿瘤的发生。Lynch综合征的患者出生时已携带一个MMR等位基因突变（通常称为杂合性突变），当其另一个遗传自健康亲代等位基因受到点突变、杂合性缺失或甲基化等二次打击时，可以引起错配修复系统的功能下降，从而使得复制错误累积引起MSI，增加细胞自发突变的频率，进而促进结直肠癌的发生。

大约有12～17%的结肠癌可检测到微卫星不稳定（因检测方式不同，比例有所异）［6］，其中约27.1%的微卫星不稳定是由MMR种系突变所致，即Lynch综合征；而大部分具有微卫星不稳定的结肠癌则为散发的［7］。主要原因是在散发的结直肠癌中MLH1上游启动子甲基化引起MLH1基因沉默，MMR蛋白功能受损，进而导致微卫星不稳定。

三、临床病理特点

Lynch综合征的患者具有以下临床特点：（1）发病年龄早，对于MLH1和MSH2突变携带者，结直肠癌的中位发病年龄为45岁；（2）好发于右半结肠，约占70.9%；（3）第二原发结直肠癌的发病率高，其中同时性占18.1%，异时性约占24.2%，其发病率还与原发病灶手术切除范围相关［8-9］。因此，提高Lynch综合征的诊断率，加强高危人群的筛查尤为重要。

四、诊断流程及常用实验室方法

自从1991年HNPCC国际合作组织（HNPCCICG）制定了Amesterdam标准以来，Lynch综合征的临床诊断标准历经数次变革。目前常用的临床标准有Amesterdam II和改良的Bethesda指南［10］（图1）用于在临床中选择进行MSI检测的患者。但二者均难以兼具敏感性及特异性：前者的特异性较高，敏感性低；后者反之。

图1 改良版Bethesda标准

近期一项针对4项大型结直肠癌家系人群研究的数据分析显示，广泛的MMR筛查对于Lynch综合征的诊断敏感性为100%，优于Bethesda标准的87.8%的敏感性［7］。因此，利用分子遗传学检测在MMR基因中发现致病性胚系突变仍为目前Lynch综合征的诊断的金标准。NCCN指南已明确指出，对于发病年龄小于70岁的或虽大于70岁但满足改良Bethesda标准的所有结直肠癌患者在术后选择辅助化疗前均需进行Lynch综合征的筛查，流程见图2。

对于MSI的检测可采用两种途径。一种是免疫组化的方法观察4种MMR蛋白在细胞核和临近肿瘤组织中的表达情况。若4个蛋白均表达，说明该患者为错配修复功能完整（pMMR）；若其中任一阴性表达，则判断为错配修复功能缺陷（dMMR）。另一种是通过PCR的方法扩增微卫星位点，常用检测位点是美国NCI专家推荐的5个标准位点：BAT26、BAT25、D2S123、D5S346 和 D17S250。比较正常组织和肿瘤组织，如果两个以上位点存在MSI则认为该患者高度微卫星不稳定（MSI-H），即dMMR，小于2个位点MSI或无一位点存在MSI者被认定为低度微卫星不稳定（MSI-L）或微卫星稳定（MSS），即pMMR。此方法之后又经过不断完善，目前认为两种方法是等效的，一致性高达97.8［11］。免疫组化的好处在于其结果可直接指导对应基因的突变检测，因为某个蛋白的丢失往往意味着其基因水平的缺陷。

图2 筛查流程

由于部分散发性结直肠癌可因MLH1启动子区域的甲基化而表现为MLH1表达缺失，且这部分患者常伴随BRAF（通常为V600E）突变，而在Lynch综合征的患者中则无此突变［12］。因此，在观察到MLH1/PMS2表达缺失时，首先需完善BRAF V600E体细胞突变或MLH1启动子甲基化的检测，以除外散发性结直肠癌。

长久以来，BRAF突变的检测主要依赖于测序的方法，包括Sanger 一代测序、焦磷酸盐测序以及质谱分析等方法。Capper D等［13］于2011年报道了一个可用免疫组化手段检测的BRAF V600E突变情况新型特异性抗体VE1，但在结直肠癌的检测中，该抗体一度因与Sanger等其他基因检测结果的一致性较低而备受争议。目前学界普遍认为，造成IHC在结直肠癌中检测的准确率低下的主要原因之一在于研究者过于宽松的阳性标准。研究发现，当把BRAF IHC染色中——强阳定义为阳性结果时，VE1抗体的敏感性和特异性分别为85%和68%。若将任何强度的染色阳性定义为阳性结果，则特异性会降至51%，而敏感性却没有提升。因此建议仅将VE1抗体染色强阳性的标本定义为阳性病例［14］。Vakiani E等对117例结直肠癌标本的BRAF V600E突变情况进行了检测，研究将＞80%的肿瘤细胞染色弥漫阳性定义为IHC阳性病例，结果发现，IHC方法与测序一致性较高，敏感性93.7%，特异性95.6%［15］。高度提示应用IHC的方法对Lynch综合征进行筛选，除外MLH1启动子甲基化的散发性患者的可行性。

根据最新的筛查指南，MLH1表达缺失的患者除BRAF V600E突变检测外，可选择性进行MLH1启动子区域的甲基化的检测。目前应用较多的是第二代甲基化特异性的PCR 法（methylation-specific PCR，MS-PCR）和特异性甲基化多重连接依赖的探针扩增（methylation specific-multiplex probe amplification，MS-MLPA）。二者优点在于所需DNA总量较小，适用于微切割的石蜡组织，临床应用较多；而甲基荧光技术Methy Light尽管是甲基化检测的金标准，但所需技术水平较高。Pérez-Carbonell L等利用上述两平台对73例MLH-1表达缺失的结肠癌的MLH1甲基化水平进行检测，结果发现二者的一致性达92%，可分别使67%和64%的患者免于进行MLH1胚系突变检测［16］。只有对BRAF V600E突变和（或）MLH1启动子甲基化检测阴性的MLH1失表达的结直肠癌患者，考虑Lynch综合征可能性大。此时需进行最终的胚系突变检测。既往对于MSH2、MSH6或PMS2表达缺失者，可直接进行相关基因的胚系突变检测以确诊Lynch综合征。近年研究发现，位于2号染色体临近MSH2的EPCAM基因（又称TACSTD 1）的3`区域的常见缺失，可引起MSH2基因体细胞高甲基化，而继发于EPCAM基因突变的肿瘤表现为MSH2和（或）MSH6的表达缺失，但胚系突变检测阴性，提示EPCAM基因的胚系突变是除4个已知MMR基因外造成Lynch综合征的重要原因［17］。据估计，高达30% MSH2免疫组化检测阴性的结直肠癌存在EPCAM基因的胚系突变。而这部分患者占全部Lynch综合征的6%［18］。因此，目前推荐对于MSH2/MSH6免疫组化阴性的患者首先进行MSH2基因的胚系突变检测，阴性者再依次进行EPCAM及MSH6的突变检测。

目前常用的有1、2代测序两种方法，相比于Sanger一代测序技术，二代测序（next generation sequencing，NGS）采用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。与一代相比，二代测序方法更加高效、便捷，而且大大降低了成本，成为目前主要检测手段。但由于其读长相对较低的局限性，尚无法撼动Sanger一代测序的金标准地位。由于大片段缺失和重排占已知突变的20%，因此，对于MMR相关的胚系突变检测需包括DNA测序及大片段缺失和重排的检测［19］。而多重连接依赖的探针扩增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）方法是国际上通用的检测大片段缺失的方法，因此，对于NGS检测阴性者，需进行MLPA检测。

二代测序结果发现突变的患者，我们利用LOVD 数 据 库（http：//chromium.lovd.nl/LOVD2/colon_cancer/variants.php）和NCBI Clinvar数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）进行基因突变致病性判读。判读结果分为5类：致病突变、疑似致病突变、临床意义未明突变、疑似非致病突变、非致病突变。对于阳性结果需进一步采用Sanger测序进行验证。但是目前参考的数据来源大多为欧美人种的研究结果，而越来越多的研究显示中国Lynch综合征的人群在发病特点和突变基因的分布上与欧美人种存在差异。国外研究一致显示子宫内膜癌是发病率最高的肠外肿瘤，累计终身患病风险在15～71%［20］，而国内以胃癌最为常见，且不断有基于中国人群的研究发现新的MLH1、MSH2、MSH6突变位点［21］。以上均提示Lynch综合征作为一种遗传性疾病，其致病基因谱在人种间的差异，进一步说明在国内积极开展Lynch综合征的筛查，建立中国人群Lynch综合征相关数据库的必要性。

五、累计风险及长期随访

经过上述检测确诊Lynch综合征的患者，意味着终身患癌风险的显著增加。目前对于药物降低肿瘤风险的证据不足。仅CAPP-2一项随机对照研究显示，相比于安慰剂对照组，长于两年每日口服600 mg 阿司匹林的患者结直肠癌及Lynch相关肿瘤的发生率降低且有统计学意义［22］。但长期高剂量的阿司匹林的副作用堪忧，目前尚不作为常规推荐应用。而一项前瞻性的研究显示，严格的随访和监测可显著降低结直肠癌的发病率和死亡率［23］。因此，2015年的NCCN/ASCO/ESMO等Lynch综合征的相关指南均建议对于MLH1/MSH2/EPCAM突变的患者，自20～25岁开始每1～2年进行结肠镜检查，若家族中先证者于25岁前发病，则随诊时间提前至发病年龄前的2～5年开始。不同于MLH1突变者早发、高发结直肠癌的特点，MSH6突变的患者子宫内膜癌的发病风险更高；而PMS2突变的患者，结直肠癌及子宫内膜癌的发病风险均相对较低。因此，NCCN指南建议对这部分患者的结肠镜检查可开始于25～30岁，若先证者发病年龄早于30岁，则于发病年龄前2～5年开始结肠镜筛查，每1～2年一次。鉴于Lynch综合征的患者同时增加了罹患肠外肿瘤的风险（中枢神经系统1.2%～3.7%，胰腺4%）［24］，对于该部分患者的筛查还需包括肠外器官的监测和随访。目前NCCN明确推荐，对于已生育女性，选择性口服避孕药或预防性双侧输卵管切除以预防子宫内膜癌及卵巢癌的风险；同时明确非功能性子宫出血需及时检查。但尚无证据显示定期的B超、CA125检测及子功内膜活检有助于降低子宫内膜癌及卵巢癌的风险，仅作为临床医生选择性应用。此外，指南还建议自25～30岁开始，考虑每年行尿常规检查以降低尿路上皮癌的发生。而对于胃、小肠、胰腺、乳腺以及中枢神经系统，尽管有研究显示上述器官的发病风险有所增加，但尚无明确的证据显示定期的监测随访有助于发病率的降低［25］。

综上，Lynch综合征作为结直肠癌中最常见的一类遗传性肿瘤综合征，发病率相对较高，且具有发病年龄早、易发生肠外及第二肿瘤的特点。现有的临床诊断标准难以兼具敏感性及特异性。因此，临床中对于结直肠癌患者应积极选取以分子病理及遗传基因为基础的检测手段，对Lynch综合征的患者及其家系进行筛查，并对阳性患者进行科学的监测、随访以降低该病的发病率及死亡率。

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