超高效液相色谱—串联质谱法测定荔枝花粉花蜜中吡唑醚菌酯及其代谢物

王思威 刘艳萍 孙海滨

摘 要 采用改进的QuEChERS方法结合超高效液相色谱-串联质谱技术，建立了荔枝花粉和花蜜中吡唑醚菌酯及其主要代谢物BF 500-3的分析方法。样品经乙腈提取，分别由乙二胺-N-丙基硅烷 （PSA） 和十八烷基键合硅胶吸附剂 （C18） 净化、浓缩后进样分析，正离子扫描、多反应监测模式下，对基质匹配标准溶液定量分析，考察了前处理和质谱分析条件。结果表明，吡唑醚菌酯及其代谢物在1～100 μg/L浓度内，基质匹配标准溶液线性关系良好，相关系数（R2）为0.991～0.999。花粉和花蜜基质中的平均回收率为87.0%～97.8%，相对标准偏差（RSD）为1.3%～3.7%，检出限（LOD）为0.08～0.20 μg/kg，定量限 （LOQ）为0.20～0.50 μg/kg。 本方法简便、快速、灵敏度高，适于荔枝花粉和花蜜样品中吡唑醚菌酯及其代谢物的快速测定。

关键词 超高效液相色谱-串联质谱；吡唑醚菌酯；代谢物；花粉；花蜜

1 引 言

吡唑醚菌酯属于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，于2001年在德国上市使用。甲氧基丙烯酸酯（Strobilurins）类杀菌剂具有对非靶标物低毒、对环境友好等特点。吡唑醚菌酯的主要代谢产物是BF 500-3（Methyl-N-[[[1-（4-chlorophenyl）-pyrazol-3-yl]oxy]-o-tolyl]-carbamate，结构式见图1），被认为与其母体具有相似的毒性[1]。目前，美国和加拿大已将吡唑醚菌酯的残留量定义为吡唑醚菌酯母体及其代谢物BF 500-3之和[2，3]，规定吡唑醚菌酯在不同作物上的残留限量[2，3]分别为0.04～40 mg/kg和0.2～200 mg/kg，均暂无荔枝及相关蜂产品上残留限量规定； 国家标准GB 2763-2016规定了吡唑醚菌酯母体在荔枝上的最大残留限量值为0.1 mg/kg[4]，暂无吡唑醚菌酯在各种植物花粉及花蜜中残留限量的相关规定。因此，建立荔枝花粉和花蜜等不同基质中母体及代谢物的分析方法十分必要，可为该药母体及代谢物的残留水平判定、残留限量制订等提供基础。

目前，有关吡唑醚菌酯母体的分析方法报道较多[5～14]，代谢物BF 500-3分析的相关文献很少，仅有在玉米和鱼体中的残留分析研究报道[15～17]，主要使用高效液相色谱法（HPLC-UV）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）等，蜂蜜及花粉基质中农药的前处理方法主要采用固相萃取小柱（SPE）、基质分散固相萃取（MSPD）、QuEChERS等净化方法[18～20]。本研究在较为成熟的QuEChERS方法基础上进行优化，结合超高效液相色谱-串联质谱技术，建立了荔枝花粉和花蜜中吡唑醚菌酯母体及主要代谢产物BF 500-3的测定分析方法，样品用量少、简便、快速，提高了前处理及检测效率。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Agilent LC-1200高效液相色谱-串联AB Sciex 4000Q Trap 质谱仪，配电喷雾离子源（ESI）； Milii-Q超纯水机（美国Millipore公司）； LD5-2A离心机（雷勃尔医药公司）； OA-SYS氮吹仪（美国）； XW-80A涡旋仪（上海精科有限公司）。

乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）； 甲酸（色谱纯，美国Fluka公司）； 无水MgSO4、NaCl、二水合柠檬酸钠、柠檬酸二钠盐（国药集团化学试剂有限公司）； 十八烷基键合硅胶吸附剂 （C18）、乙二胺N-丙基硅烷吸附剂 （PSA）（上海安谱实验科技股份有限公司）； 吡唑醚菌酯标准品（99.5%，美国Chem Service公司）； BF 500-3标准品（99.9%，德国巴斯夫公司）。

2.2 实验方法

2.2.1 样品处理 实验中所用花粉和花蜜样品均来自荔枝龙眼产业体系示范园中的荔枝花粉和蜜蜂采集的荔枝蜜。其中花粉样品是将花朵样品采回，待花药自然晾干裂开后，获得花粉样品。（1）花粉准确称取荔枝花粉样品2.0 g，置入50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，再加入8 mL超纯水和3 mL正己烷进行提取，继续加入4 g无水MgSO4、1 g NaCl、1 g二水合柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸二钠盐，立即剧烈振荡，涡旋1 min，5000 r/min离心2 min。取6 mL乙腈溶液至加有0.9 g无水MgSO4、0.15 g PSA， 0.15 g C18的离心管中，立即手动剧烈振荡，涡旋10 s，5000 r/min离心2 min。取上清液4 mL至10 mL錐形管中，氮吹至约50 μL，用含0.1%甲酸的乙腈定容至1 mL，过0.22 μm滤膜，待测。（2）花蜜 准确称取荔枝花蜜样品5.0 g，置入50 mL离心管中，加入10 mL超纯水，使其充分溶解花蜜样品达到均匀状态，然后加入10 mL乙腈进行提取，继续加入4 g无水MgSO4、1 g NaCl、1 g二水合柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸二钠盐，剧烈振荡，涡旋1 min， 5000 r/min离心2 min。取6 mL乙腈至加有0.9 g无水MgSO4、0.15 g PSA的离心管中，手动剧烈振荡，涡旋10 s，5000 r/min离心2 min。移取上清液4 mL至10 mL锥形管中，氮吹近干，用含0.1%甲酸的乙腈定容至1 mL，过0.22 μm滤膜，待测。

2.2.2 色谱-质谱条件 （1）色谱 色谱柱为Poroshell-120 EC-C18 （150 mm×3.0 mm， 2.7 μm）； 流动相A为0.1%（V/V）甲酸溶液，B为乙腈，A∶B=25∶75（V/V），运行7 min； 流速 0.4 mL/min； 柱温35℃； 进样量5 μL。（2）质谱 ESI+，多反应监测模式，离子源温度550℃，气帘气压30 psi，毛细管电压5500 V，雾化气压力50 psi。其它相关参数见表1。

3 结果与讨论

3.1 前处理条件优化

3.1.1 提取方式选择 对比了固相萃取技术（SPE）、基质固相分散萃取技术（MSPD）和QuEChERS方法（图2）。结果表明，采用氨基SPE和石墨化碳黑SPE，吡唑醚菌酯和BF 500-3的回收率低于50%，采用C18，洗脱速率极慢，回收率较低。MSPD方法相比于SPE，提取和净化可同时完成，但对于脂肪含量较高的花粉样品需要经过2次以上的净化过程，才能较好地去除杂质，费时费力； QuEChERS方法具有快速、简单、有效的特点，通过加入不同量的PSA和C18吸附剂，能够较好地去除脂类、糖类等共萃取物质，回收率满足分析要求，适于本研究中目标农药的分析测定。

3.1.2 提取溶剂的选择 对比了丙酮、乙酸乙酯和乙腈作为提取剂时吡唑醚菌酯和BF 500-3的提取效果。结果表明，丙酮极易与水互溶，提取过程中共提取物质较多，尤其是色素和脂肪，净化效果较差，增加了后续吸附剂的选择难度及净化过程的复杂程度； 乙酸乙酯微溶于水的特性导致其不能将强极性的目标农药从基质中完全提取，回收率低； 乙腈与水互溶，且通过NaCl盐析作用，可使水-乙腈两相界面分层明显，且基质相对干净。因此，本研究选择乙腈作为提取溶剂。

3.1.3 提取溶剂用量确定 以添加水平100 μg/kg的花蜜为研究对象，分别考察了5、10和15 mL乙腈对吡唑醚菌酯和BF 500-3的提取效率。结果表明，采用10 mL乙腈能达到充分提取目标分析物的目的。本研究使用的花粉中有较高含量的脂肪酸和脂肪酸酯类化合物，它们是蜂蜡的主要成分，通过在提取步骤中加入非极性的正己烷，可以有效去除该类化合物干扰。对加入正己烷的用量进行了考察。当正己烷的用量<3 mL时，不能将非极性干扰杂质完全去除； 当正己烷的用量≥3 mL时，目标物的回收率稳定不变，且有小圆饼状的油脂物析出，杂质去除效果良好。基于节约溶剂和环保的考虑，选择正己烷用量为3 mL。

3.1.4 吸附剂的选择 针对不同基质特点，选择有效吸附剂。无水MgSO4作为干燥剂，主要用于除去水分，避免分析物保留在水中而不易被有机溶剂充分提取； PSA为弱阴离子交换填料，能够有效去除基质中糖类、脂肪酸等物质； C18吸附剂为硅胶基质键合十八烷基填料，具有比表面积大、吸附能力强的特点，可较好除去脂类、脂肪等非极性物质的干扰。由于花蜜中的干扰杂质相对花粉较少，主要含有约70%葡萄糖和果糖，采用PSA可有效去除糖类物质； 花粉中含有大量脂类、黄酮类和糖类等成分，采用PSA+C18联合应用能够有效去除油脂等干扰。

3.1.5 吸附剂用量的确定

以添加水平为100 μg/kg的花粉为研究对象，分别考察了0.05、0.10、0.15和0.2 g的PSA和C18对吡唑醚菌酯和BF 500-3的净化效果。结果表明， 0.15 g PSA和0.15 g C18联用使用，可明显改善花粉的净化效果，回收率均在80%以上，满足分析要求。

3.2 仪器条件优化

3.2.1 流动相的选择 吡唑醚菌酯在甲醇中溶解度为100.8 g/L，在乙腈中溶解度>500 g/L，因此选择乙腈-水相体系作为流动相。水相中添加甲酸使目标物形成[M+H]+离子模式，并以[M+H]+作为母离子能够获取较强的离子碎片，且响应较高，目标物的峰形更对称，提高了检测的灵敏度。由于吡唑醚菌酯和BF 500-3在酸碱条件下（pH 为5、7、9）均很稳定[20]，因此不需要加入乙酸铵形成缓冲体系。

3.2.2 质谱条件优化 将吡唑醚菌酯及其代谢物BF 500-3标准溶液0.1 mg/L采用单针自动进样分析，可产生稳定的[M+H]+离子，确定目标农药的准分子离子峰，并优化去簇电压。准分子离子峰进入二级质谱，发生断裂或重排等碎裂反应，产生不同的离子碎片，在选择离子监测模式下，优化其碰撞能量（二级离子质谱图见图3）。

3.3 基质效应

基质效应表现为对目标化合物的信号增强或抑制作用。考察了吡唑醚菌酯及其代谢物BF 500-3在试剂和花粉、花蜜基质中的响应情况（添加水平100 μg/kg）。结果表明，采用标准溶液进行实验的回收率均低于花粉和花蜜两种基质标准溶液，说明基质对分析物表现为基质抑制效应，原因可能是花蜜和花粉2种基质中含水量低，导致基质共萃物浓缩。本实验采用基质匹配溶液校正基质效应的方法，确保实验结果的准确性。

3.4 方法的线性范围及检出限

由表2可知，在1～100 μg/L范围内，吡唑醚菌酯和BF 500-3的花粉和花蜜基质匹配标准溶液的峰面積与对应的质量浓度间呈良好的线性关系，相关系数（R2）均>0.990。以3倍信噪比（S/N=3）计算的花蜜和花粉中的检出限 （LOD），以10倍信噪比（S/N=10）确定定量限 （LOQ）。鱼体中吡唑醚菌酯和BF 500-3的LOD和LOQ分别为5 和10 μg/L[15]； 玉米中吡唑醚菌酯的LOD和LOQ分别为0.45～5 μg/kg和2～20 μg/kg，BF 500-3的LOD和LOQ分别为1～4 μg/kg和2～10 μg/kg[16]。本方法的LOD和LOQ均低于文献中的报道。

3.5 实际样品分析

对某地区5个示范园荔枝花粉和花蜜样品进行检测，均未检出吡唑醚菌酯及其代谢物。在10～100 μg/kg添加水平下，吡唑醚菌酯和BF 500-3在荔枝花粉和花蜜中的平均添加回收率分别为87.0%～96.4%和90.5%～97.8%， 相对标准偏差（RSD）分别为1.3%～3.5%和2.3%～3.7%（见表3、图4）。方法回收率为60%～120%，RSD<20%，符合残留分析检测要求[21]。

上述实验结果表明，本方法所用样品量少、方便、快捷，且净化效果好， 采用基质匹配标准溶液消除基质效应，适用于快速检测荔枝花粉和花蜜中吡唑醚菌酯和主要代谢产物BF 500-3。

References

1 http：//www.epa.gov/pesticides/chem_search/cleared_reviews/csr_PC-099100_9-Oct-01 a.pdf

2 https：//www.ecfr.gov/cgi-bin/text-idx？SID=f9d542711a66ba5c0a2206dce8428c32&mc;=true&node;=se40.26.180_1582&rgn;=div8

3 https：//www.canada.ca/en/health-canada/services/consumer-product-safety/pesticides-pest-management/public/consultations/proposed-maximum-residue-limit/2016/pyraclostrobin-2/document.

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