锦鲤厦门希瓦氏菌的分离鉴定及药敏试验

苗淼 吕爱军 胡秀彩 韩卓然 王景桂 陈成勋 孙敬锋

摘要：【目的】明确引起锦鲤发病死亡的原因及其病原菌的药敏特性，为生产中有效防治该病提供科学依据。【方法】采用常规方法从患病锦鲤的肝脏中分离病原菌，经形态观察、生理生化鉴定和16S rDNA序列分析确定其种属，通过人工感染试验判断病原菌的致病性，并以纸片扩散法测定其药物敏感性。【结果】综合分离菌株的形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析结果，可确定其为厦门希瓦氏菌。人工感染试验证明，从患病锦鲤肝脏分离获得的厦门希瓦氏菌具有较强毒力，其对斑马鱼的半数致死量（LD₅₀）为2.30x0⁴CFU/mL。厦门希瓦氏菌对阿莫西林、红霉素、头孢克肟、头孢哌酮、头孢噻肟、美罗培南、亚胺培南、阿奇霉素、克林霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素和氟苯尼考等14种药物高度敏感，但对氨苄西林、左氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、利福平、链霉素、依诺沙星、磺胺异恶唑和甲氧嘧啶等抗生素已产生耐药性。【结论】厦门希瓦氏菌可感染引起锦鲤发病死亡，且具有较强毒力，实际生产中可选用阿莫西林、美罗培南、亚胺培南、庆大霉素、新霉素、卡那霉素、头孢哌酮、头孢克肟、头孢噻肟和阿奇霉素等抗生素进行防治。

关键词：锦鲤；厦门希瓦氏菌；分离鉴定；生理生化特性；药敏试验

0引言

【研究意义】锦鲤（Cyprinus carpio var.Koi）又称绯鲤，隶属于鲤形目（Cypriniformes）鲤科（Cyprini-dae），是一种亚热带淡水观赏鱼，其体色艳丽、体格健美、泳姿优美，具有极高的观赏价值。随着社会经济不断发展和人民生活水平的提高，锦鲤在国内已拥有广阔的市场，但因育苗工厂化快速发展过程中养殖密度过大而造成其患病率和死亡率居高不下，严重制约了锦鲤养殖产业的健康发展。当前，锦鲤疱疹病等病毒性疾病仍是造成其死亡的重要原因，且细菌性疾病发生日益频繁，如铜绿假单胞菌、少动鞘氨醇单胞菌、维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌（李梅等，2010；辛伟涛等，2011；姜娜等，2012；陳凯等，2015）等均可引起锦鲤不同程度的发病死亡。因此，加强锦鲤的病理学研究对确保其养殖产业可持续健康发展具有重要意义。【前人研究进展】希瓦氏菌属（Shewanella）是1985年MacDonell和Colwell根据5srRNA序列进行系统发育分析后建立的新属，为革兰氏阴性杆菌，主要腐败鱼、虾类等海产品。厦门希瓦氏菌（S.xiamenensis）隶属于希瓦氏菌属，从我国福建省厦门沿海的海洋沉积物中首次分离获得（Huang et al，2010），此后又在一位胰腺炎患者术后放置的胰周引流管中检测出厦门希瓦氏菌（zong，2011）。厦门希瓦氏菌分布广泛，不仅分布在水体沉积物中，还广泛存在于淡水、海水和污水中（Huanget al，2010）。目前，国内外已有希瓦氏菌引起水产动物发病的研究报道，包括海藻希瓦氏菌（S algae）和腐败希瓦氏菌，尤其是腐败希瓦氏菌已被证实不仅可感染海水鱼类如金带蓝子鱼也能感染淡水养殖鱼类如鲤鱼和鳟鱼。秦蕾等（2012）首次从患病异育银鲫的体表病灶和内脏中分离鉴定出腐败希瓦氏菌，推测腐败希瓦氏菌作为一种潜在的新病原也会对异育银鲫养殖造成威胁。此外，周康等（2015）通过建立鲤鱼腐败希瓦氏菌的生长动力学模型，发现以Baranyi模型的预测效果最佳，能有效地进行食品安全预警；郭全友等（2016）探讨了环境因子对大黄鱼腐败希瓦氏菌生长计数分析的影响，结果表明，平板计数法和浊度法均可对腐败希瓦氏菌生长/非生长进行有效判断，但环境因子强度较大时宜采用平板计数法。【本研究切入点】随着锦鲤市场需求量的增长和养殖工厂化程度的提高，其病害发生日趋频繁，尤其是细菌性疾病（李梅等，2010；辛伟涛等，2011；姜娜等，2012；陈凯等，2015）已成为制约锦鲤养殖产业健康发展的主要因素之一，但至今鲜见厦门希瓦氏菌引起锦鲤发病死亡的相关报道。【拟解决的关键问题】2017年6月天津市某锦鲤养殖场的鱼群出现大批量发病死亡现象，且各年龄段锦鲤均有发病，给养殖户造成巨大经济损失。因此，亟需对患病锦鲤进行病原分离鉴定和致病性分析。在常规微生物分类鉴定的基础上，采用16S rDNA序列分析进行分子生物学鉴定，并通过药敏试验筛选敏感药物，旨在为生产中有效防治该病提供科学依据。

1材料与方法

1.1试验材料

患病锦鲤取自天津某锦鲤养殖场；人工感染试验所用的斑马鱼购白天津市中环花鸟鱼虫市场，体长3.24±0.5 cm，体重0.354±0.10g。营养琼脂、胰蛋白胨和酵母提取物购自北京奥博星生物技术有限公司；细菌微量生化鉴定管及配套试剂购自杭州微生物试剂有限公司；药敏纸片购自杭州滨河微生物试剂有限公司，试验用抗生素：阿莫西林（10μg/片）、氨苄西林（10μg/片）、红霉素（15μg/片）、头孢克肟（5μg/片）、头孢哌酮（75μg/片）、头孢噻肟（30μg/片）、头孢氨苄（5μg/片）、美罗培南（10μg/片）、亚胺培南（10μg/片）、万古霉素（30μg/片）、阿米卡星（30μg/片）、庆大霉素（10μg/片）、卡那霉素（30μg/片）、链霉素（10μg/片）、新霉素（30μg/片）、阿奇霉素（15μg/片）、克林霉素（2μg/片）、四环素（30μg/片）、左氧氟沙星（5μg/片）、萘啶酸（30μg/片）、诺氟沙星（30μg/片）、恩诺沙星（5μg/片）、氯霉素（30μg/片）、呋喃妥因（300μg/片）、利福平（5μg/片）、依诺沙星（10μg/片）、氟苯尼考（30μg/片）、磺胺异亚唑（300μg/片）、甲氧嘧啶（5μg/片）和复方新诺明（1.25/23.75μg/片）。

1.2病原菌分离

选取患病症状明显的锦鲤在无菌条件下解剖，取其肝脏，剪碎后在LB固体培养基（营养琼脂330g/L，NaCl 1 mol/L，pH 7.0～7.2）上划线，28℃培养18h；挑选单个优势菌落接种至新的LB固体培养基上，28℃再培养18h，纯化获得的纯种菌株命名为JLR。同时将纯化后的菌株接种到LB液体培养基中，28℃培养18 h后与40%甘油按1：1的比例进行混合，混匀后-20℃保存备用。

1.3病原菌分类鉴定

1.3.1形态观察及生理生化鉴定JLR菌株在LB固体培养基上（294±1）℃培养16h后进行革兰氏染色观察；生理生化特性采用细菌微量生化鉴定管对JLR菌株进行各项生理生化指标测定，具体操作参照细菌微量生化鉴定管使用说明。

1.3.2 16S rDNA序列分析采用水煮法提取JLR菌株的DNA（冯广达等，2013），并以此为DNA模板进行16S rDNA序列PCR扩增，其通用上游引物为27f：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游引物为1492r：5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反应体系20.0μL，包括2xMaster Mix 10.0μL，上、下游引物各1.0μL，DNA模板1.0μL，无菌双蒸水7.0μL。扩增程序：94℃预变性5 min；94℃30 s，55℃30 min，72℃90 s，进行30个循环；72℃延伸10 min。以1.0%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，然后送至金维智生物科技（北京）有限公司测序。测序结果在GenBank中进行BLAST比对分析，并从比对结果中挑选出与之相关的种属菌株序列，采用MEGA 5.0进行多序列匹配分析，最后以邻位相连法（Neighbor-ioining method）构建系统发育进化树。

1.4人工感染试验

选取游动快速、反应敏捷的斑马鱼60尾，于（25±2）℃、pn 6.7-7.3的水箱中暂养1周，养殖期间连续供氧，试验前1d停止喂食。感染试验在25 cmx15cmx5cm的塑料鱼槽中进行，具体操作参照吕爱军等（2011）、胡秀彩等（2012）的方法：先以LB液体培养基培育JLR菌悬液[（29±1）℃，16h）]，获得的菌悬液在4℃下2000 r/min离心10 min，弃上清液，加入0.89%NaCl进行稀释，调整菌悬液浓度。感染试验设6个处理组（1个对照组和5个试验组），5个试验组对应的菌悬液浓度分别为3.68x10⁷、3.68x10⁶、3.68x10⁵、3.68x10⁴和3.68x10³CFU/mL，每尾腹腔注射10.0μL；对照组注射等量生理盐水（0.89%NaCl）。试验期间不喂食，每天观察和记录鱼体发病情况，及时捞出死亡个体，连续观察7 d。按1.2的方法对死亡鱼体进行病原菌分离，并采用BLISS方法计算菌株对斑马鱼的半数致死量（LDso）。

1.5药敏试验

采用纸片扩散法对JLR菌株的药物敏感性进行检测，然后根据药敏纸片的抑菌范围标准进行结果判定（饶颖竹等，2016）。

2结果与分析

2.1患病锦鲤的症状表现

发病初期，病鱼游动缓慢，摄食量减少，有浮头现象；病鱼体表充血，眼球凹陷，肛门两侧肌肉糜烂，胸鳍和尾鳍均有出血点，鱼鳃充血发红（图1）。

2.2 JLR菌株的形态特征及生理生化特性

JLR菌株经LB固体培养基培养后可观察到淡褐色的圆形菌落，边缘整齐，中央轻微凸起，表面光滑，不透明；其菌体革兰氏染色呈阴性，无芽孢，短杆状（图2）。JLR菌株的生理生化鉴定结果（表1）表明，其氧化酶反应、接触酶反应和硝酸盐还原反应呈阳性，M.R.试验、V-P试验和苯丙氨酸反应呈阴性；无动力；可发酵利用葡萄糖（O-F发酵型），但不能利用棉籽糖、木糖、山梨醇、侧金盏花醇和柠檬酸盐；可发酵产生硫化氢及鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶，但不产生吲哚，即JLR菌株的生理生化特性与厦门希瓦氏菌高度相似。

2.3 16S rDNA序列分析结果

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，发现在1500 bp附近出现单一清晰的目的条带（图3），其测序结果显示，JLR菌株的16S rDNA序列长度为1484 bp，与预期结果一致。经BLAST比对分析，发现JLR菌株与厦门希瓦氏菌的同源性在99.0%以上。从基于16SrDNA序列构建的系统发育进化树（图4）也可看出，JLR菌株与厦门希瓦氏菌（HQ418493）聚为一支，即二者的亲缘关系最近。

综合JLR菌株的形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析结果，可确定其为厦门希瓦氏菌（S.xiamenensis）。

2.4人工感染试验结果

由表2可知，菌悬液浓度为3.68x10⁷和3.68x10⁶CFU/mL两个试验组的斑马鱼在攻毒后48 h内全部死亡，3.68x10³CFU/mL试验组斑马鱼在攻毒后7d内的累积死亡率为70%，对照组的斑马鱼在整个试验期间均未出现病理变化和死亡现象。采用BLISS方法计算得知，JLR菌株对斑马鱼的LD₅₀为2.30x10⁴CFU/mL。发病初期斑马鱼游动缓慢或沉于水底，体表有明显出血症状；从死亡斑马鱼的内脏团中可分离出与JLR菌株形态特征和生理生化特性一致的优势菌株。

2.5药敏试验结果

由表3可知，JLR菌株对阿莫西林、红霉素、头孢克肟、头孢哌酮、头孢噻肟、美罗培南、亚胺培南、阿奇霉素、克林霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素和氟苯尼考等14种药物高度敏感，对头孢氨苄、万古霉素、四环素、呋喃妥因和阿米卡星等5种抗生素中度敏感，对氨苄西林、左氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、利福平、链霉素、依诺沙星、磺胺异恶唑和甲氧嘧啶等抗生素已产生耐药性。

3讨论

希瓦氏菌是海淡水养殖环境中常见的细菌类群，目前有关希瓦氏菌感染淡、海水鱼类的研究报道较多，但感染厦门希瓦氏菌的案例很少。厦门希瓦氏菌与奥奈达希瓦氏菌（S.oneidensis）的亲缘关系最近，与腐败希瓦氏菌也具有一定的亲缘关系（秦蕾等，2012）。从希瓦氏菌的生理生化特性来看，奥奈达希瓦氏菌可将硝酸盐还原成亚硝酸盐和一氧化氮，表现出过氧化氢酶活性（Venkateswaran et al，1999）。腐败希瓦氏菌的氧化酶和接触酶反应呈阳性，可发酵产生鸟氨酸脱羧酶，但不产生脲酶；不发酵葡萄糖、山梨醇、棉籽糖、侧金盏花醇和木糖；V-P试验和M.R.试验呈阴性；能利用柠檬酸盐，产硫化氢但不产吲哚（Kozifiska and Pekala，2004；Holt et al，2005；秦蕾等，2012）。本研究从患病锦鲤的肝脏中分离获得厦门希瓦氏菌，其与腐败希瓦氏菌和奥奈达希瓦氏菌相比，最明显的区别是厦门希瓦氏菌可利用葡萄糖。

药敏试验可为疫病防治的科学用药提供重要参考依据，但实际用药时需严格执行国家有关渔药使用的规定及政策，避免抗生素滥用及违禁药物的使用，防止病原菌产生耐药性（陈凯等，2015；饶颖竹等，2016）。锦鲤厦门希瓦氏菌的药敏试验结果表明，其对阿莫西林、红霉素、头孢克肟、头孢哌酮、头孢噻肟、美罗培南、亚胺培南、阿奇霉素、克林霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素和氟苯尼考等14种药物高度敏感，但对氨苄西林、左氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、利福平、链霉素、依诺沙星、磺胺异恶唑和甲氧嘧啶等抗生素已产生耐药性。虽然部分抗生素如红霉素、氯霉素、左氧氟沙星等在养殖过程中已经禁用，但对厦门希瓦氏菌的抗菌谱研究及其分类地位鉴定仍具有重要指导意义。厦门希瓦氏菌对亚胺培南、美罗培南、头孢菌素等抗生素高度敏感，与希瓦氏菌属对大部分β-内酰胺类抗生素较敏感的观点相符（Sivolodskil et al，2012）。此外，厦门希瓦氏菌对萘啶酸、利福平、恩诺沙星和左氧氟沙星等抗生素不敏感，但秦蕾等（2012）研究发现腐败希瓦氏菌对这些抗生素较敏感，具体原因有待进一步探究。

本研究的人工感染试验结果表明，厦门希瓦氏菌具有较强毒力，其对斑马鱼的LD₅₀为2.30x10⁴CFU/mL，说明厦门希瓦氏菌作为一种条件性致病菌会对锦鲤养殖造成巨大威胁。尤其是养殖过程中，当养殖密度过大或水体污染时，鱼体因逆境胁迫而造成机体抵抗力下降，此时为致病菌的入侵创造了有利条件，进而导致鱼体感染发病甚至大量死亡。该结论为进一步研究厦门希瓦氏菌的多样性及分子生物学特性打下了基礎。

4结论

厦门希瓦氏菌可感染引起锦鲤发病死亡，且具有较强毒力，实际生产中可选用阿莫西林、美罗培南、亚胺培南、庆大霉素、新霉素、卡那霉素、头孢哌酮、头孢克肟、头孢噻肟和阿奇霉素等抗生素进行防治。