CRISPR/Cas9系统及其在作物育种中的应用
2018-05-30黄娟邓国富高利军高菊卿冬进朱昌兰
黄娟 邓国富 高利军 高菊 卿冬进 朱昌兰
摘要：基因编辑是一项对目的基因进行修饰的新技术，由成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly in-terspaced short palindromic repeats，CRISPR）及其关联蛋白（CRISPR associated，Cas）组成的系统（CRISPR/Cas）为新一代基因编辑技术，其中Cas9蛋白与CRSPR结合形成的编辑系统CRISPR/Cas9因其简单易操作的特性已广泛应用于植物基因组编辑，发展潜力巨大。文章论述了CRISPR/Cas9系统的作用原理、发展历程及在植物基因组中的定点编辑效应，并分析CRISPR/Cas9在水稻、小麦、玉米等作物育种中的应用现状，发现其在改良水稻产量和质量相关性状、小麦白粉病抗性及玉米乙烯敏感等性状上效果明显。在今后的研究中，应针对不同作物的育种目标，深入了解目标基因的功能作用来设计相应的操作方案，并提高该系统对作物目的基因改良的效率，加强其安全性等，以促进基因编辑在作物育种中的应用，加快育种进程。
关键词：作物育种；基因编辑；CRISPR/Cas9系统；定点修饰
0引言
基因编辑是对基因组进行定点修饰的一项新技术，其原理是通过序列特异性核酸酶进行精确定位，对靶标DNA片段进行剪切或插入新基因片段使基因沉默或同源重组，达到目标性状表达的目的（王亚萍等，2017；沈兰等，2017）。随着高通量测序技术的不断发展，许多作物的基因组测序工作已相继完成。面对大量的基因组信息，科研工作者需诠释其功能，并有效应用于生产生活（景润春和卢洪，2016）。近十年来，农杆菌介导的外源DNA随机插入和RNA下调基因表达成为反向遗传学分析基因功能的一种有效方法，但存在不可控性、干扰调控遗传稳定性差等缺陷，阻碍其在作物育种中的应用和发展。正向遗传学分析则是利用传统的基因重组、突变等方法，经过多世代选择来培育新品种，存在耗时长、工作量大等弊端，其中分子标记辅助育种（MAS）常因多代回交和连锁累赘而丢失分子标记，影响作物育种进程。随着人工核酸酶的出现和真核细胞技术体系的完善，基因组编辑技术飞速发展，将靶向基因操作推向高潮（Bogdanove and Voytas，2011；Jinek et al，2012；Cong et al，2013；Shan etal，2013），为作物育种工作提供了新途径。
目前，主要有3种基因编辑技术：（1）锌指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFN）技术，该技术是第1代基因组编辑技术。ZFN是由一个锌手指DNA结合域和一个取自限制性内切酶的DNA切割结构域所组成的融合蛋白，可结合并切割基因组位点（Bibikovaet al，2001；Umov et al，2005）。（2）轉录激活因子样效应核酸酶（Transcription activator-like effector nu-cleases，TALEN）技术，该技术已逐步取代ZFN技术，其原因是TALEN能特异性识别DNA序列，具有较强的设计性，不受上、下游序列影响，较ZFN技术更具有应用潜力（Christian et al，2010）。（3）成簇规律间隔短回文重复及其关联蛋白（CRISPR/Cas），CRIS-PR/Cas是古细菌和细菌用于清除外源入侵DNA的一种免疫系统，其靶序列的结合特异性是由单向导RNA（sgRNA）和原间隔序列基序（PAM）共同决定。其中Cas9蛋白无需形成蛋白二聚体，利用向导RNA（gRNA）进行碱基互补配对决定靶序列的特异性（Barrangou et al，2007；Gasiunas et al，2012），因此，CRISPR/Cas9系统相比之下极大降低了技术门槛，一经面世就迅速得到广泛应用。
1CRISPR/Cas9系统
自1987年CRISPR簇从大肠杆菌的基因组被鉴定出以来（Ishino et al，1987）即倍受关注（Moiica etal，1995，2000），至2005年其生物学功能被确认（Moiica et al，2005）。CRISPR簇的基因序列与病毒和质粒上的基因序列具有同源性，说明其在细胞中发挥适应性免疫作用（Bolotin et al，2005；Pourcelet al，2005）。CRISPR簇附近存在一系列保守的基因Cas，编码具有核酸功能的Cas蛋白，两者结合可保护细胞而抵制病毒人侵，形成基于RNA介导的DNA打靶免疫机制（Brouns et al，2008；Marraffniand Sontheimer，2008；Gameau et al，2010）。
根据Cas基因核心元件序列的差异，CRISPR/Cas免疫系统被分为3种类型（Ⅰ、Ⅱ和IⅡ型），其中Ⅱ型系统最简单，来自酿脓链球菌（Jinek et al，2012），其特征性蛋白为Cas9蛋白，经改造成为序列特异性核酸酶，与ZFN和TALEN一样具有靶向切割DNA序列的功能，称为CRISPR/Cas9系统。该免疫系统是原核细胞通过整合间隔序列而获得，间隔序列是入侵DNA的一小片段，位于CRISPR簇末端的2个相邻重复序列之间。CRISPR簇（包括其间隔序列）在与入侵的DNA匹配后被转录，加工成小干扰CRISPRRNA（crRNA），长度约40 nt，再与反式激活CRISPRRNA（TracrRNA）结合对Cas9核酸酶进行激活，引导其切割入侵的DNA（Dekcheva et al，2011；Jinek etal，2012）。在入侵DNA上被切割的同源双链DNA序列称为原间隔序列（Barrangou et al，2007），其被切割的先决条件是入侵DNA下游存在一段保守的原间隔序列基序（PAM），通常为5'-NGG-3'序列（Gasiunas et al，2012），但剪切的特异性是由PAM上游约12个基础序列决定。当crRNA和目的DNA相匹配，Cas9核酸酶在gRNA的引导下对DNA特定位点进行切割，DNA双链断裂产生两端的单链NHEJ（Non-homologous end ioining）可介导目的性突变（Cristea et al，2013；Maresca et al，2013）。已有研究表明，当一段序列与断裂双键DNA周围的序列为同源序列时，DNA即可能被同源修复（Homologousrecombination，HR），该机制可用于精确地修复或插入基因（Puchta，2005）。
研究表明，仅改变crRNA数十个核甘酸即可重新设置目标DNA，且其与TracrRNA融合为sgRNA时可保证剪切的特异性，成功实现CRISPR/Cas系统从生物学现象到基因工程工具的转变（Jinek et al，2012）。此外，哺乳动物基因组编辑的实现也证明了CRISPR/Cas9和sgRNA构成的系统在真核细胞中发挥编辑作用（Cong et al，2013；Jinek et al，2013；Hwang et al，2013；Mali et al，2013），尤其是具有不同序列的多重gRNA可同时在不同位点实现高效的多重基因组修饰（Cong et al，2013；Mali et al，2013）。可见，CRISPR/Cas9系统是一个简单、廉价、多样化的基因编辑工具，导致其相关研究成为热点（Bortesi and Fischer.2014）。
2CRISPR/Cas9系统在植物基因组的定点编辑
来自细菌等微生物的CRISPR/Cas9系统作为基因工程工具已广泛应用于人类及哺乳动物等真核生物研究（Cong et al，2013；Mali et al，2013）。为将其应用于植物，植物科学家开展了大量研究。自2013年8月首次报道利用CRISPR/Cas9系统对植物基因组进行编辑（Li et al，2013；Nekrasov et al，2013；Shan et al，2013）以来，大量相关研究相继开展（Feng et al，2013；Xie and Yang，2013）。这些研究分别以拟南芥、生烟、水稻和小麦等植物为供试材料，通过转基因技术将优化的Cas9基因和gRNA转入植物体内，实现了植物基因组的定点编辑，证明该技术在植物生物学研究领域具有极高的应用价值。随后该技术被应用于高梁（Jiang et al，2013）、玉米（Liang et al，2014）、甜橙（Jia and Wang，2014）、番茄（Ron et al，2014）、地钱（Sugano et al，2014）、大豆（Cai et al，2015）、大麦（Lawrenson et al，2015）、甘蓝（Lawrenson et al，2015）、杨树（Zhou et al，2015）、棉花（Iqbal et al，2016）、甘蔗（Mohan，2016）、亚麻荠（Jiang et al，2016）等作物。这些研究结果如突变频率、剪切特异性、位点结构辨识（Jiang et al，2013；Miao et al，2013；Shan et al，2013；Xie andYang，2013；Fauser et al，2014；Feng et al，2014；Zhang et al，2014；Cai et al，2015；Mikami et al，2015）、创造大片段染色体缺失、同源重组的潜在性及脱靶概率等（Mao et al，2013；Gao et al，2014；Zhou et al，2014；Ma et al，2015；Xie et al，2015；Xu et al，2015；Li et al，2016a）可为后续研究提供参考。
通过对各世代转基因苗的检测发现，在水稻（Zhou et al，2014；Ma et al，2015）、小麦（Zhang etal，2016）、番茄（Brooks et al，2014）、拟南芥（Wanget al，2015）、玉米（Char et al，2016）等作物的第1代转基因植株中就可获得双等位或纯合突变，且该系统在生殖细胞中诱导获得的遗传突变可通过正常的生殖方式遗传给下一代（Brooks et al，2014；Feng etal，2014；Ma et al，2015；Wang et al，2016）。另外，可通过T1或T2代的分离选择含有目的基因修饰而不含转基因的单株，而CRISPR/Cas9瞬时表达的基因组编辑体系可避开外源DNA插入获得纯合的T0代突变体，保证材料的安全性（zhou et al，2014；Char etal，2016；Gao et al，2016；Wang et al，2016；Li etal，2016b）。这些研究结果为进一步的育种应用提供了可靠依据。
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CRISPR/Cas9系统在作物育种中的应用
3.1在水稻育种中的应用
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，并已成为重要的模式植物，相对于小麦复杂的基因组背景，水稻的基因编辑更易操作。2013年，Shan等首次对水稻中的OsPDS、OsBADH2和OsMPK2等基因进行修饰，并获得了OsPDS基因编辑后双位点纯合的突变植株，为水稻基因定點突变的提供技术参考。有研究表明，水稻的苯达松抗性基因Bel功能丧失会导致植株对苯达松敏感（Pan et al，2006），该特性可用于两系杂交水稻种子的生产，通过基因编辑使雄性不育系对苯达松敏感，杂交种子被不育系自交污染的问题就可通过在苗期喷洒苯达松来解决。Xu等（2014）利用日本晴为材料，对其Bel基因第二内含子上的目的序列进行编辑，获得双等位变异、对苯达松敏感的转基因苗，有效提高杂交稻生产安全性。Zhou等（2016）利用CRISPR/Cas9系统使水稻温敏型雄性不育基因tms5发生特异性突变，以此开发出11个无转基因成分的改良TGMS品系，在水稻的籼亚种和粳亚种中均具有巨大育种潜力，有效利用了水稻杂种优势。水稻生产中杂草防治是决定产量的重要因素之一，目前草甘膦已成为世界上使用量最大的除草剂。Li等（2016c）利用基因定点替换和定点插入两种方法实现了水稻内源5-烯醇丙酮酰莽草酸3-磷酸合成酶基因（OsEPSPS）保守区两个氨基酸T102I和P106S（TIPS）的定点替换，在T0代获得了TIPS定点替换的杂合体，其对草甘膦表现抗性，且TIPS突变能稳定地遗传给下一代。Wang等（2016）利用CRISPR/Cas9系统修饰稻瘟病侵染效应因子基因OSERF922，以提高对水稻稻瘟病抗性，结果表明，通过T1和T2代分离可获得仅含目的基因修饰成分而不含转基因的植株，且6个T2代纯合突变株系在苗期和分蘖期的稻瘟病感染率均较野生型大幅度降低，但其他农艺性状上无明显差异。水稻产量和品质相关基因多为数量性状控制，基因编辑为水稻育种提供新思路和新方法。Miao等（2013）利用CRISPR/Cas9系统编辑水稻分蘖基因LAZYI，使其发生双等位变异，结果表明T1代转基因幼苗的分蘖数量明显增多。Shen等（2016）利用CRISPR/Cas9系统对5个粳稻品种的粒型基因GS3和穗粒数基因Gnla进行编辑，导致基因突变失活，从而获得粒长和穗粒数均明显增加的株系，但其产量明显下降。Li等（2016c）利用CRISPR/Cas9系统对水稻品种中花11的4个产量相关基因dep1、gnla、gs3和inal进行编辑，结果表明T2代gnla、depl和gs3基因突变使其穗粒数增加，穗型密集，籽粒变长，但ipal，基因突变产生两个相反的表型，一种为分蘖减少、茎秆变粗，另一种为分蘖增多、株高变矮。Xu等（2016）利用CRISPR/Cas9系统对粒重基因GW2、GW5和TGW6同时进行编辑，结果得到gw5tgw6和gw2gw5tgw6突变体，其粒重较野生型品种粳稻LH422明显增加，且3个基因问无互作关系。沈兰等（2017）利用CRISPR/Cas9系统对4个优质水稻品种定向改良粒长和穗粒数性状，结果显示从T1代即可获得无选择标记的突变体，其中gs3和gs3gnla突变体的粒长和千粒重较野生型明显增加，表明该系统在水稻品种的定向改良工作中应用潜力巨大。综上所述，利用CRISPR/Cas9系统对水稻目的基因进行编辑和修饰可实现较理想的突变，有效推进水稻品种改良和育种进程，虽然部分性状未达到预期效果，但通过进一步研究和改进一定能达到预期效果。
3.2在小麦育种中的应用
小麦是异源多倍体，其基因组庞大，高倍性和高度重复的DNA序列使得其正向和反向遗传分析均难以进行。MLO是白粉病抗性基因（Buschges etal，1997）。在小麦中，3个MOL同源基因（TaMLO-Al、TaMLO-B1和TaMLO-D1）在核酸和蛋白水平上的一致性分别为98%和99%。六倍体小麦3个MLO同源位点均发生自然变异或可遗传的突变非常困难，因此至今尚未见有天然的或诱导的MLO基因突变的研究报道。Shan等（2013）利用CRISPR/Cas9系统成功诱导面包小麦原生质体中MLO基因突变。Wang等（2014）在此基础上采用CRISPR/Cas9系统对单个TaMLO位点进行诱导，最终获得变异植株，经过不完全检测，从72个T0转基因小麦株系中鉴定出4个独立的突变体，其植株携带的突变在TaMLO-Al基因位点上各不相同，表明CRISPR/Cas9系统可在多倍体的面包小麦中诱导形成有利突变。利用TALEN诱导的TaMLO突变中出现了基因型为tamlo-aabbdd的植株，经鉴定其叶子上出现白粉菌落的数量急剧减少，说明基因编辑可培育持久、广谱抗性的面包小麦原材料。由此可见，通过优化CRISPR/Cas9系统可扩大转基因苗的选择数量而达到育种效果。Zhang等（2016）利用CRISPR/Cas9瞬时表达系统对影响小麦籽粒性状和分蘖的基因TaGASR7和TaDEPI进行编辑，结果在T0代即可获得小麦纯合敲除突变体，且突变体的千粒重和分蘖数明显增加，但株高降低。
3.3在玉米育种中的应用
玉米是最重要的粮饲兼用作物，其籽粒中的植酸占总磷含量的75%，具有抗消化特性，无法被单胃动物消化，易污染环境。因此，降低玉米籽粒的植酸含量非常重要。Liang等（2014）利用CRISPR/Cas9系统对玉米植酸生物合成中的一个催化酶基因即肌醇1，3，4，5，6-戊基磷酸2激酶基因（ZmIPKIA）进行编辑，并进行细胞质体瞬时表达分析，结果显示，该基因发生插入和缺失碱基的变异，表明CRISPR/Cas9系统可有效诱导其突变，为选育低植酸含量的玉米品种提供新途径。Svitashev等（2015）利用CRISPR/Cas9系统敲除玉米的乙酰乳酸合酶基因ALS2，获得了抗磺胺脲成分除草剂的玉米植株。Shi等（2017）同样利用CRISPR/Cas9系统获得了玉米AGROS8突变体，其对乙烯利的敏感性明显降低，抗旱能力也有所提高，故在干旱胁迫下其籽粒产量仍较高。虽然很多突变体的性状与预期培育品种仍存在一定差距，但随着基因编辑技术的不断完善，对其进一步基因改良，终会获得人们生产所需的高产优质新品种。
4展望
传统育种手段仍是当今农业生产上获得新品种的主要方法，其周期长、见效慢，且很多作物品种的选育难有重大突破。为解决传统育种手段的弊端，将转基因技术应用于作物育种，以此拓宽品种选育的遗传基础，加快育种效率，但新品种被转入其他物种的基因或DNA片段后，其安全性受到质疑。应用基因编辑技术进行作物育种，虽然操作过程类似于转基因，但操作对象是自身基因，通过基因编辑使其沉默表达或获得等位变异的突变体，从而精确达到育种目标，新品种的安全性更高，因此该技术受到广大科技人员的青睐，虽然目前该技术还存在很多不足，但发展和应用前景巨大。
4.1提高CRISPR/Cas9系统对目的基因的改良效率
CRISPR/Cas9系统在植物细胞中的应用是基于序列核酸酶特异性切割及DNA自我修复。虽然目前已有大量研究报道，各种作物在细胞原生质体水平上的基因编辑均有较高的誘变率，可获得预期的转基因苗（Shan et al，2013；Brooks et al，2014；Feng et al，2014；Zhang et al，2014；Zhou et al，2014；Wang et al，2014；Ma et al，2015），但成苗率较低，只有增加前期基因编辑的工作量，扩大选择范围才能获得预期的育种材料。由于突变和非突变的细胞以随机方式再生成为幼苗，因此在Cas9和gRNA表达的细胞中增加突变细胞的比例将获得更多可遗传突变植株。已有研究表明，Cas9核酸酶的表达水平与突变频率呈正相关，延长培养周期可提高突变细胞的比例及突变类型的多样性，促使整个系统提高获得非嵌合再生植株的能力（Mikami et al，2015）。CRISPR/Cas9系统导人植物细胞中会出现切割一修复一切割的往复操作，从而产生无效循环，降低CRISPR/Cas9系统对目的基因的修饰效果。Wolfs等（2016）研究认为，可通过加入一种RNA导向双活性位点酶（TevCas9酶）在目的位点产生两个不兼容的DNA断裂，有效删除目的位点的主要部分使其不再重新出现，以保证特异性地靶定基因。另外，CRISPR/Cas9瞬时表达系统可避免外源DNA的插入而获得突变体，保证育种材料的安全性。这些技术的改进提高了CRISPR/Cas9系统对目的基因的编辑效率，为作物育种提供技术支持。
4.2针对不同作物及基因功能设计相应的操作方案
目前，对不同种类植物进行基因编辑，其突变频率不同，编辑效果也存在差异（Xie and Yang，2013；Fauser et al，2014；Cai et al，2015；Ma et al，2015；Li et al，2016b），因此对目的基因编辑前，要全面评估并设计针对性的操作方案。植物是一个有机整体，基因问存在互作效应，简单地基因敲除并不能达到预期目标，如Shen等（2016）对影响水稻产量的穗粒数和粒长基因进行敲除时，产量未按预期效果得到增长。在对目的基因进行编辑时，要充分了解其功能原理及其与其他基因问的互作效应，如反式作用因子、顺式作用元件等对基因的调控等，根据育种目标设计基因编辑方案，以期获得理想的育种材料。另外，多数基因编辑中涉及转化过程，有些物种在转化过程会出现褐化致死的现象，限制了基因编辑的利用效率，如水稻的籼稻亚种（顾之中等，1992）、荔枝（范翠娜和刘国杰，2006）等。在提高编辑突变效率的同时，需针对不同品种配套选择培养方法以获得更多突变植株，提高作物育种效率。
