一株酸枣内生菌的鉴定及其抗菌活性物质的初步分离

邓振山 高飞 刘玉珍 魏婷婷 李静 李征霆

摘 要：为了从酸枣中筛选出内生菌并分析其代谢产物中的活性成分，用于开发和生产药物，该研究通过组织块分离法和划线分离法，从陕北野生酸枣植株体内分离得到内生菌，采用平板对峙法测定其对7株供试指示菌的抗菌活性，以心神宁片提取液为对照，对各拮抗菌株的发酵液进行薄层层析和高效液相色谱分析。结果表明：从野生酸枣中共分离得到121株内生菌，其中内生细菌49 株，内生放线菌6株，内生真菌66株;通过抗菌试验，发现54株内生菌（细菌33株，真菌21株）对1～7种指示菌具有抗菌活性，占分离菌株总菌数的44.63%，其中A-04、A-05、B-03、C-03、C-06和D-04共6株菌株的抗菌谱较广，对7种供试指示菌均具有抑菌活性;薄层层析检测结果显示菌株B-03 发酵产物在Rf值为0.46处有与酸枣提取液层析带迁移率相同的显色带，液相色谱分析结果显示其属于黄酮类物质;通过16S rRNA基因序列分析结果显示菌株B-03与Bacillus axarquiensis的相似性为99%。菌株B-03能发酵产生黄酮类或产生与黄酮类类似的化合物，表明酸枣内生菌具有合成黄酮类药物的潜力。

关键词：酸枣， 内生菌， 代谢产物， 黄酮类物质

中图分类号：Q946

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2018）11-1486-07

Abstract：The purpose of this study was to identify endophytic strains from Ziziphus jujube and analyze the active components of their metabolites for the development and production of drugs. Wild Ziziphus jujube plants from North Shaanxi were adopted as experimental materials， and endophyte strains were isolated by approaches of tissue separation and streak plate， then they were screened and tested on the bacteriostatic activity by adopting indicators of seven strains from face-to-face cultivation in PDA media. The fermentation liquor of antagonistic strain was detected using thin layer， chromatography（TLC） and high performance liquid chromatography （HPLC） . The experimental results showed that a total number of 121 strains of endophytes were isolated from Ziziphus jujube， including 49 strains of endophytic bacteria， 6 strains of endophytic actinomycetes， and 66 strains of endophytic fungi. Among of them， 54 strains （33 bacteria and 21 fungi） had obvious antagonistic activity against 1-7 indicative bacteria， accounting for 44.63% of the total， and six strains （A-04， A-05， B-03， C-03， C-06 and D-04） had a broad spectrum of antibacterial and antibacterial activity against seven strains of indicator microbes. Results from the analysis of TLC and HPLC showed that liquor in B-03 strain has the same color band with the migration rate of Ziziphus jujube extract in Rf value of 0.46， and its belonged to flavonoids. According to 16S rRNA gene sequences analysis. The similarity between strain B-03 and Bacillus axarquiensis was 99%. The strain of B-03 could produce flavonoids or similar compounds， which showed that the endophytes from Ziziphus jujube had the potential ability to produce new drugs of flavonoids.

Key words：Ziziphus jujube var. spinosa， endophyte， product of metabolism， flavonoids

植物內生菌是定植于健康植物组织内，不引起明显外观病症的一类微生物（Chihaoui et al，2015;Mufti et al，2015）。迄今为止已发现的内生菌普遍存在于高等植物中，主要包括三类即内生细菌、内生真菌和内生放线菌（Pandya et al，2015）。内生菌与药用植物在长期的协同进化过程中一方面形成了特殊的互惠共生关系，内生菌对药用植物的生长、道地性、产量、质量、功效成分、抗逆性等方面都产生了重要影响;另一方面，药用植物内生菌自身产生的一些药用活性物质，在新药研发、菌肥开发、生防菌研发、工业化酶生产应用等方面都显示出巨大的开发潜力。我国药用植物资源极为丰富，其中蕴含着大量不为人知的内生菌类群，这一宝贵资源亟待人们去探索与开发（邢晓科，2018）。Stierle et al（1993）的研究结果表明内生菌能产生与宿主植物相同或相似的药用活性物质。之后，陆续有相关的研究报道如从植物内生菌中发现抑菌、抗肿瘤等活性物质。从植物内生菌中分离得到的活性物质约有51%为新化合物（罗红丽等，2012）。由此可见，药用植物内生菌在活性物质分离方面具有重要的研究价值。

酸枣（Ziziphus jujube var. spinosa），为鼠李科枣属植物，果肉、种仁、叶和根均可入药，具有养肝静心、安神敛汗的作用，经济与药用价值极高（郑强卿等，2014）。近年来，关于酸枣仁生物碱及脂肪酸类成分的研究很多，如从酸枣种仁中分离出环肽类生物碱 jubanine（Pandey & Sin，2008）。迄今为止，大多对酸枣的研究主要集中在酸枣仁的药理药效和化学成分方面（曹琴和王凯伟，2009），而关于酸枣产生药用活性成分内生菌的报道则鲜见有报道。因此，本研究以陕北野生酸枣植株为材料，从中分离筛选出具有抗菌活性的菌株，并对其次生代谢产物进行初步研究，以期为寻找新型化合物产生菌和开发利用新型活性物质提供重要线索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物 新鲜野生酸枣植株体（包括根在内），于2013年4—11月份采自陕西省延安市延安大学文汇山和凤凰山，取样后避光保存于4 ℃下，2 d内处理完毕。

1.1.2 指示菌株 本研究所用的指示菌株均由延安大学医学院提供，保藏于延安大学生命科学学院微生物实验室中，具体见表1。

1.1.3 供试培养基 固体分离培养基：（1）牛肉膏蛋白胨培养基;（2）马铃薯葡萄糖琼脂培养基;（3）高氏Ⅰ号培养基;（4）察氏培养基;（5）水琼脂培养基;（6）改良无机盐淀粉培养基（可溶性淀粉2 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4 0.5 g，KNO3 1 g，NaCl 0.4 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.2）;（7）酵母膏培养基（酵母浸膏0.25 g，K2HPO4 0.5 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.2）;（8）液体发酵培养基（PDA不加琼脂）。

1.2 方法

1.2.1 内生菌的分离与纯化

1.2.1.1  内生真菌的分离纯化 内生真菌的分离采用组织块法（张新国等，2016）。分离材料用自来水冲洗，进行预处理，然后依次用95%的酒精浸泡1～5 min后无菌水冲洗4～5次，0.1%的升汞浸泡3～8 min后无菌水冲洗7～8次，75%的酒精浸泡3～5 min，无菌水冲洗4～5次进行表面消毒。最后在无菌状态下切成0.2 cm×0.2 cm的小块，接到PDA固体培养基中，每平板接2～4个组织，于（27±1）℃恒温静置培养2～3 d;观察材料切口处菌丝（菌落），挑取切口处菌丝，转接到新的PDA培养基上继续培养，然后对所分离的内生真菌进行纯化，纯化后转接到PDA斜面上编号并保存。同时，将最后一次淋洗的无菌水涂布在培养基上作为对照，于恒温培养箱中静置培养，检验表面消毒效果。

1.2.1.2  内生细菌的分离纯化 采用组织块分离法和划线分离法对酸枣中的内生细菌进行筛选（刘学周等，2014），在超净工作台下对酸枣植株体表面进行消毒，表面消毒方法同内生真菌。将表面消毒好的材料在无菌状态下切成0.2 cm×0.2 cm的小块，接到牛肉膏蛋白胨固體培养基和高氏I号培养基中，每平板接2～4个组织，于（27±1）℃恒温静置培养2～3 d。待培养基中有可见菌落时，挑取周围菌落移入相应培养基纯化，并进行菌落形态描述和编号，于4 ℃冰箱中保存备用。将最后一次冲洗的无菌水涂布于培养基上作为对照，于恒温静置培养，检验消毒效果。

1.2.2 内生菌抗菌活性测定 采用打孔注入法测定上述分离得到的内生菌的抗菌活性。将分离纯化好的内生菌菌种和7株供试指示菌分别接种于PDA平板上，待菌株生长旺盛后，用接种环挑取少量菌体，接种于已灭菌的发酵培养基中，置于恒温摇床上振荡培养，温度28 ℃，转速160 r·min-1，振荡培养时间1～2 d后，用已灭菌的棉签将供试指示菌均匀涂布于PDA固体培养基上，在涂好的培养基上用已灭菌的打孔器（r=0.5 cm）在四周打上四个孔，用移液枪将待测的内生菌发酵液注入孔中，以注入无菌水为对照，置于28 ℃恒温培养箱中培养2～3 d后，观察各菌株的抑制作用，待抑菌圈不再变化时，用刻度尺测量抑菌圈大小（邓振山等，2016;郑艳等，2016）。

1.2.3 活性菌株液体发酵及产物的提取 从斜面挑取纯化拮抗菌种接种于PDA液体发酵培养基中，置于恒温摇床上振荡培养，温度（27±1）℃，转速160 r·min-1，振荡培养6～7 d后，用16层纱布过滤，分为菌体和发酵液两部分，发酵液先后用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，于旋转蒸发仪中减压浓缩至5 mL 左右，再用5 mL 甲醇溶解，所得液体经0.22 μm 的微孔滤膜过滤，浓缩后于4 ℃冰箱中保存备用（姚晓玲等，2014）。

1.2.4 薄层层析（TLC）分析 对上述分离得到的样品进行TLC分析，展开剂为氯仿∶甲醇（8∶1，v/v），用碘粉熏蒸显色，并通过紫外光下的显色反应作进一步验证（梅宇飞等，2012）。

1.2.5 高效液相色谱（HPLC）分析 分别取少量芦丁甲醇溶液、菌株发酵液和心神宁片提取液，经0.22 μm微孔滤膜过滤后，再进行HPLC分析。HPLC分析的检测条件：Shimadzu ODS C18 色谱柱（150 mm ×4. 6 mm，5 μm），柱温25 ℃，流动相为甲醇：0.2%磷酸溶液（v∶v）=1∶1，进样量10 μL，流速0.8 mL·min-1，检测波长260 nm（张仁堂等，2012）。

1.2.6 菌株B-03的鉴定 （1）形态特征观察：将菌株B-03划线接种在牛肉膏蛋白胨培养基上，28 ℃培养24 h，观察记录单菌落形态;采用革兰氏染色法判断是革兰氏阴性还是阳性菌。（2）分子鉴定：对B-03菌株16S rRNA基因片段进行PCR扩增（正向引物Pl：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′，反向引物P6：5′-TACGGCJ′ACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′），PCR反应体系及条件见图2和图3。将PCR扩增产物送至上海生工生物工程股份有限公司测序，所得序列与GenBank数据库进行比对，采用MEGA5.0软件构建系统进化树，分析菌株的系统发育学特征，获得GenBank登录号（王艳等，2017）。

2 结果与分析

2.1 酸枣内生菌的分离结果

对酸枣植株体进行内生菌分离，得到121个菌株。其中从叶中分离到38株，分别为C-01～C-38，占分离总菌数的31.40%，从根中分离到34株，占分离总菌数的28.10%，从茎中分离到29株，占分离总菌数的23.97%，从果实中分离到20株。可见酸枣叶中分离的内生菌最多，果实中的最少。分离得到内生真菌66株，占总菌数的54.55%，细菌49株，占总菌数的40.50%，放线菌6株，占总菌数的4.96%，可见本研究从酸枣中分离的的内生真菌最多，细菌次之，放线菌最少见。

2.2 抗菌活性的测定结果

抗菌活性结果表明，从酸枣植株体分离的121株内生菌中有54株对一种或多种指示菌具有一定的抑制作用，占筛选菌株的44.63%。表3列举了15株不同内生菌的抗菌测试结果，它们多数具有广谱抗性。由表5可知，A-04、A-05、B-03、C-03、C-06和D-04这6株内生菌对7种指示菌均有不同程度的抑制效果，占筛选菌株的13.33%，结果表明这6株内生菌具有较广的抗菌谱和较高的抗性。其中菌株B-03抑菌效果最明显，最大抑菌圈直径达到35 mm，因此将其选作进一步研究的菌株。

2.3 TLC分析结果

薄层层析（TLC）检测结果表明，菌株B-03在Rf为0.46处有与心神宁片提取液颜色相同，迁移率相当的显色斑，紫外光下显黄色荧光，初步判断B-03菌株具有能够发酵产生與心神宁片中相似的部分化学物质的能力。

2.4 HPLC分析结果

经过分离纯化的发酵产物的HPLC图谱显示，芦丁标准品在保留时间Rf=5.015 min处有一主要吸收峰， 心神宁片提取液出峰顺序依次为组分A在保留时间Rf=2.015，组分B在保留时间Rf=2.375，组分C在保留时间Rf=2.952，组分D在保留时间Rf=3.394，组分F在保留时间Rf=4.986各有一主要吸收峰。 菌株B-03的发酵产物的出峰顺序依次为组分a在保留时间Rf=2.023，组分b在保留时间Rf=3.398，组分c在保留时间Rf=3.932，组分d在保留时间Rf=5.782各有一主要吸收峰。由此可知，组分a与A、b与D的保留时间接近，组分d与芦丁标准品主要吸收峰保留时间接近，初步判断该菌株能够发酵产生与心神宁片成分相似的黄酮类物质。

2.5 菌株B-03的鉴定

2.5.1 形态特征观察 菌株B-03在牛肉膏蛋白胨培养基上形成的菌落呈淡黄色，不透明，不粘稠，边缘整齐;通过光学显微镜观察发现菌体呈杆状，革兰氏染色呈阳性。

2.5.2 分子鉴定 菌株B-03的16S rRNA序列（登陆号KY848236）与GenBank数据库进行Blast比对分析，与其同源性较高的菌株均属于芽孢杆菌属，其中与Bacillus axarquiensis同源性最高（99.3%）。

3 讨论

本研究结果表明酸枣根、茎、叶、果实组织中均存在大量内生菌，其中一部分内生菌对人体7种常见致病菌具有不同程度的活性抑制作用，这与毕江涛等（2012）植物内生菌具有抗菌活性的结果是一致的，表明药用植物酸枣内生菌具有广泛的抗菌活性，为筛选具有广谱性和选择性的抗菌药物提供了资源。然而，在筛选优势内生菌方面，对传统的筛选条件还有待于进一步改进，采用新型的筛选方法和技术，从而充分挖掘优势植物内生菌资源。

王梅霞等（2003）发现银杏内生菌可以产生黄酮类化合物;杨晓军等（2006）从湖北恩施蛇足中分离到1株真菌，并从其发酵液中得到一种异黄酮。这进一步证明了药用植物内生菌具有产生与宿主活性成分相同或相似化合物的能力。然而，由于实验过程中提取方法、展开剂、显色剂、柱压等条件的限制，菌株B-03的次级代谢产物也并非仅限于黄酮类化合物，故仍需利用其它生物化学手段进行提取、纯化、鉴定，从而充分挖掘该菌株次级代谢产物的多样性。

本研究采用薄层层析、高效液相色谱等方法对产与心神宁片化学成分相同或相似化合物的内生菌次生代谢产物进行分析，但并未涉及其他拮抗菌株产抑菌活性物质的研究。因此，

还需要从以下几个方面对酸枣内生菌进行研究：（1）对供试菌有较强抑制作用的内生菌生物防治方面的进一步研究;（2）菌株B-03发酵液中所含成分的进一步鉴定，发酵条件和提取方法的优化;（3）菌株是否具有药用活性，以便为今后利用内生菌发酵生产天然药用活性成分提供有利的理论依据。相对于已经有很多研究的其它微生物来说，药用植物内生菌作为一类新的微生物资源具有很好的开发潜力及潜在的商业价值。