PEI-Fe3O4纳米颗粒载siRNA向人皮肤角质形成细胞系HaCaT的递送

陈佳玉，张殿宝，李 莹，王丽平，王浩林

(中国医科大学1.第一临床学院；2.基础医学院，辽宁 沈阳110122)

人皮肤角质形成细胞(keratinocytes)是人皮肤表皮层的主要组成部分，在皮肤表皮的稳态维系和创面修复中起关键性作用[1]。目前，自体角质形成细胞的体外培养与移植技术已应用于临床。单独使用角质形成细胞仍然在细胞归巢、移植方式和细胞存活等方面面临挑战，而对细胞进行遗传修饰已成为基因治疗的新途径。常用的转染技术(如病毒法、脂质体法和电穿孔法等)存在安全性和稳定性等问题，迄今也无高效稳定的临床级核酸递送技术[2]。本研究使用PEI-Fe3O4超顺磁纳米颗粒载siRNA向人皮肤角质形成细胞进行递送，为角质形成细胞的siRNA递送寻找新方法，以期应用于临床。

1 材料与方法

1.1 材料:人皮肤角质形成细胞系HaCaT(ATCC)，贴壁增殖，呈铺路石样；PEI-Fe3O4纳米颗粒(东纳生物公司)；DMEM培养液和FBS(Hyclone公司)；siRNA(吉玛基因公司)；Opti-MEM培养基(Gibco公司)；反转录和real-time PCR试剂盒(TaKaRa公司)；CCK- 8试剂盒(Dojindo公司)。

1.2 方法

1.2.1 PEI-Fe3O4纳米颗粒的表征：使用透射电镜(120.0 kV)观察纳米颗粒的形态和大小，透射电子显微镜样品制备依文献方法进行[3]。使用动态光散射检测纳米颗粒的流体动力学大小和Zeta电位。

1.2.2 siRNA凝胶阻滞实验：将siRNA NC(negative control，阴性对照) 1 μg按纳米颗粒/siRNA质量比为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.2混合，加opti-MEM培养基至20 μL，室温放置30 min后进行2%琼脂糖凝胶电泳，使用Tanon-1600凝胶成像系统观察并成像。

1.2.3 siRNA转染：将HaCaT细胞培养于含10% FBS的DMEM培养液，按1×105细胞/孔接种6孔板并培养过夜。将纳米颗粒与GAPDH siRNA按4 μg/1 μg、8 μg/1 μg、8 μg/2 μg和8 μg/4 μg的比例混合，室温孵育15 min后加入细胞，过夜培养后换液。siRNA序列：siRNA NC：5′-UCCG AACGUGUCACGUTT-3′；GAPDH siRNA：5′-GUAUGACAACA GCCUCAAGTT-3′。

1.2.4 Real-time PCR检测靶基因的mRNA：使用Trizol法提取细胞总RNA，使用反转录试剂盒合成cDNA，使用SYBR Green realtime PCR试剂盒在ABI 7500 PCR系统中扩增。以ACTB为内参，使用2-ΔΔCt法计算相对表达水平。引物序列如下：GAPDH上游引物5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′；ACTB上游引物5′-TGGCACCCAGCACAATGGA-3′，下游引物5′-CTAAGTCAT AGTCCGCCTAGAAGCA-3′。

1.2.5 普鲁士蓝染色观察细胞对纳米颗粒/siRNA复合物的摄取：使用4%甲醛室温固定细胞30 min，用PBS洗3次。将12%盐酸与4%亚铁氰化钾等体积混合配制普鲁士蓝染液。将细胞使用普鲁士蓝染液室温孵育30 min，核固红复染10 min，使用倒置相差显微镜观察并成像。

1.2.6 细胞毒性的检测：将细胞接种96孔板，纳米颗粒和siRNA按0.27 μg/0.07 μg转染siRNA NC，向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，每组设5个复孔。将培养板在37℃培养箱内孵育2 h。使用iMARK酶标仪测定450 nm吸光度。

2 结果

2.1 PEI-Fe3O4纳米颗粒的表征: 透射电镜下PEI-Fe3O4纳米颗粒呈致密的球状结构，平均粒径为12 nm(图1)。动态光散射检测到纳米颗粒的水动力学半径为18.34 nm，Zeta电位为+36.2 mV。

图1 透射电镜表征PEI-Fe3O4纳米颗粒Fig 1 PEI-Fe3O4 nanoparticles were characterized by TEM

2.2 siRNA凝胶阻滞实验:若siRNA与纳米颗粒形成了复合物，则不会在凝胶中迁移。随着纳米颗粒/siRNA质量比增大，条带逐渐变弱，当该比例达到1.2时siRNA被完全阻滞(图2)。

图2 PEI-Fe3O4纳米颗粒对siRNA的凝胶阻滞实验Fig 2 Gel retardation assay for PEI-Fe3O4 nanoparticles against siRNA

2.3 PEI-Fe3O4纳米颗粒载siRNA对角质形成细胞基因沉默的效率:处理24 h后，可见纳米颗粒与siRNA质量比影响沉默效率，当使用纳米颗粒8 μg和siRNA 2 μg时高达80%(图3)。

*P<0.05 compared with con group

2.4 普鲁士蓝染色检测细胞对纳米颗粒/siRNA复合物的摄取:对使用8 μg纳米颗粒和2 μg siRNA处理12 h的细胞进行普鲁士蓝染色，视野中所有细胞都有蓝色着色(图4)。

图4 普鲁士蓝染色检测细胞对纳米颗粒/siRNA复合物的摄取Fig 4 Cellular uptake of the nanoparticles/siRNA was detected by Prussan blue staining

2.5 纳米颗粒对角质形成细胞活力的影响:每孔0.27 μg纳米颗粒和0.07 μg siRNA转染24 h，实验组和对照组在450 nm处的吸光度分别为1.28±0.14和1.19±0.17。

3 讨论

本研究中使用PEI-Fe3O4超顺磁纳米颗粒向人皮肤角质形成细胞递送siRNA，使其发挥基因沉默的作用。通过凝胶阻滞实验，检测了正电性的纳米颗粒与带有负电荷的siRNA分子在不同质量比的条件下形成复合物的情况，结果表明当纳米颗粒/siRNA质量比达到1.2时，siRNA被完全阻滞，说明所有siRNA与纳米颗粒形成复合物。由于细胞主要通过内吞作用摄取纳米颗粒[3]，纳米颗粒的电性影响其与负电性的细胞膜相互吸引，而siRNA与纳米颗粒形成复合物将中和纳米颗粒的正电荷，因此需要研究确定纳米颗粒和siRNA的比例及用量，以达到最佳沉默效率。在沉默效率的结果中，6孔板每孔使用8 μg纳米颗粒和2 μg siRNA时效率高达80%，并且该浓度对细胞活力没有显著影响，说明该纳米颗粒能够有效地载siRNA对人角质形成细胞进行基因沉默。本研究中使用的纳米颗粒转染法为解决病毒法安全性差、脂质体转染体内稳定性差和电穿孔转染效率低等问题提供了新的思路和解决方案。

：

[1] Lewis CJ, Mardaryev AN, Poterlowicz K,etal. Bone morphogenetic protein signaling suppresses wound-induced skin repair by inhibiting keratinocyte proliferation and migration[J]. J Invest Dermatol, 2014, 134:827- 837.

[2] Majidi S, Zeinali Sehrig F, Samiei M,etal. Magnetic nanoparticles: Applications in gene delivery and gene therapy[J]. Artif Cells Nanomed B, 2016, 44:1186- 1193.

[3] Zhang D, Wang J, Wang Z,etal. Polyethyleneimine-coated Fe3O4nanoparticles for efficient siRNA delivery to human mesenchymal stem cells derived from different tissues[J]. Sci Adv Mater, 2015, 7:1058- 1064.