miR- 210参与调控间充质干细胞向肿瘤相关成纤维细胞转化

陈 桦，李 静，赵春华

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 组织工程中心, 北京 100005)

美国癌协会2017年发表的最新癌统计数据显示：在女性中最常见的癌中，乳腺癌发病率已居女性恶性肿瘤首位[1]。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是肿瘤微环境的重要组成部分。微环境中的炎性因子可以诱导循环的MSCs和在相邻组织中的MSCs归巢到肿瘤中，在微环境中多种因子的刺激下以肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)的形式参与了微环境中细胞基质的组成[2]。

本实验室前期初步研究发现利用乳腺癌细胞系MCF- 7与MSCs共培养为模型来模拟肿瘤微环境， MSCs可以通过分泌TGF-β等因子诱导MCF- 7细胞发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transi-tion，EMT)，提高肿瘤细胞的侵袭和转移能力[3]。本实验旨在进一步探讨肿瘤细胞对MSCs向CAFs转化的影响及发挥调控作用的关键分子。通过表达谱芯片分析MCF- 7细胞与MSCs共培养后不同时间点的基因表达谱，共培养后MCF- 7中miR- 210的表达持续上升。miR- 210是细胞缺氧后反应变化最为灵敏的miRNAs 之一，也有文献报道称miR- 210的上调与肿瘤的产生有密切联系[4]。因此，本研究提出假设：乳腺癌细胞通过上调miR- 210的表达，调节肿瘤微环境中MSCs向CAFs转化，以促进肿瘤的生长。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂：DMEM、 D/F- 12、RPMI 1640和胎牛血清(Gibco公司)；青霉素和链霉素(PS)(华北制药股份有限公司)；胶原酶P(Roche公司)；细胞转染试剂Lipofectamine 2000TM(Invitrogen 公司)；miR- 210 的模拟物和抑制剂、CAFs相关特征标志物引物(上海生工生物工程有限公司)；反转录试剂盒(TaKaRa公司)；山羊抗兔、山羊抗鼠IgG(碧云天生物有限公司)；多聚甲醛(国药集团化学试剂有限公司)。

1.1.2 细胞和动物：细胞：成人脂肪来源间充质干细胞(hAD-MSCs)取自中国医学科学院整形外科医院吸脂术患者废弃的脂肪组织分离获得。本研究经中国医学科学院基础医学研究所伦理委员会批准，供者均签订知情同意书。MCF- 7、MDA-MB- 231细胞(中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)。

1.1.3 动物：SPF级健康雌性BALB/ c-nu小鼠10只，4～6周龄，质量20～25 g(中国医学科学院基础医学研究所动物中心，合格证号：11804700014616)

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：人脂肪MSCs提取和培养的方法参见文献[3]。

1.2.2 hAD-MSCs与乳腺癌细胞系共培养：将乳腺癌细胞系与MSCs常规消化后用肿瘤培养基重悬，分别接种到带小室的Transwell 6孔板中，接种约为2×105个/孔，肿瘤培养基补齐到2 000 μL。

1.2.3 miR- 210- 3p及对照的瞬时转染和慢病毒介导的感染：MCF- 7、MDA-MB- 231的瞬时转染用Lipofectamine 2000按照说明书进行。慢病毒介导的感染由上海吉玛公司合成、包装，按说明书进行。用Lipofectamine 2000向乳腺癌MDA-MB- 231细胞转miR- 210- 3p抑制剂及对照miR- NC，转染后的细胞命名为MDA-MB- 231-miR- NC和MDA-MB- 231-miR- 210-inhibitor，共培养体系备用；用慢病毒向乳腺癌MCF- 7细胞转miR- 210- 3p抑制剂及对照LV- 3，感染后的细胞命名为MCF- 7-miR- NC和MCF- 7-miR- 210- inhibitor，动物实验备用。

1.2.4 RT-qRCR检测： 1)共培养不同时间点(0、3、6和9 d)收集的乳腺癌MCF- 7和MDA-MB- 231细胞中miR- 210的表达情况。miRNA引物序列见表1;2)共培养后MSCs向肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)转化的情况，检测CAFs相关特征标志物包括α-SMA、FAPA、tenascin-c mRNA的表达(表2)。

1.2.5 蛋白免疫印迹(Western blot)检测：CAFs相关特征标志物的蛋白水平检测方法参见文献[3]。

1.2.6 动物分组及处理： 4 ～6周雌性裸鼠10只，随机分为MCF- 7-miR- 210-inhibitor组和MCF- 7-miR- NC组，每组5只。将慢病毒感染miR- 210抑制剂和对照LV- 3的MCF- 7( MCF- 7-miR- 210-inhibitor细胞和MCF- 7-miR- NC细胞)分别与hAD-MSCs按1∶1比例(每只裸鼠接种5×106细胞)混合皮下注射到免疫缺陷的裸鼠的背部。各组动物经过上述处理后,每周定期观察裸鼠的生长状况,用游标卡尺对瘤体的长度(L)、宽度(W)进行测量，4周后取出肿瘤组织，测量肿瘤体积和质量。

表1 Real-time PCR引物Table 1 Primer sequences for real-time PCR

表2 CAFs相关特征标志物Real-time PCR引物Table 2 Primer sequence of CAFs characteristic markers

1.2.7 肿瘤组织分离培养与检测：将小鼠皮下肿瘤组织取出放入PBS中。在超净台中用含有双抗的无菌PBS清洗2次。用手术剪刀将组织剪成颗粒状。加入0.20 %胶原酶P，置于37 ℃摇床，慢摇30～60 min，用D-Hank’s终止消化。100目筛网过滤， 1 500 r/min，离心10 min ，弃去上清，保留最下面的细胞沉淀。用少量D-Hank’s重悬, 再次离心后弃去上清，加入(DMEM+10% FBS)培养基，轻轻吹打后移入T75培养瓶中。差速贴壁法，1 h后换成新的培养基。次日观察细胞的贴壁情况。从两组小鼠肿瘤组织分离培养的细胞，MCF- 7-miR- NC组共有5组分别NC- 1、NC- 2、NC- 3、NC- 4和NC- 5；MCF- 7-miR-210-inhibitor组共有5组分别为i- 1、 i- 2、i- 3、i- 4和i- 5。RT-qPCR和Western blot检测细胞α-SMA、FAPA 和波形蛋白(vimentin)的表达，内参为GAPDH。

1.2.8 HE染色：免疫组织化学观察肿瘤组织中CAFs相关标记物α-SMA和vimentin的染色情况。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 hAD-MSCs和乳腺癌细胞系(BCCs)共培养后BCCs持续上调miR- 210的表达

在人脂肪来源hAD-MSCs与乳腺癌细胞系(MCF- 7、MDA-MB- 231)分别共培养0、3、6和9 d后，MDA-MB- 231细胞miR- 210表达显著上调(P<0.05)(图1A)；与hAD-MSCs共培养不同时间点后，MCF- 7细胞miR- 210表达也显著上调(P<0.05)(图1B)。

2.2 共培养条件下促使 MSCs向CAFs转化

与乳腺癌MDA-MB- 231细胞共培养(0、3、6、12、15及21 d)后， MSCs中肌动蛋白α-SMA mRNA及腱生蛋白tenascin-c mRNA的表达量明显上调(P<0.05)(图2A,B)；共培养后的MSCs中平滑肌肌动蛋白α-SMA和成纤维细胞活化蛋白-α(FAPA)的蛋白表达也是上调的(P<0.05)(图3)。

A.expression of miR- 210 in MDA-MB- 231 after co-culture; B.expression of miR- 210 in MCF- 7 after co-culture; *P<0.05，**P<0.01 compared with untreated MCF- 7 or MDA-MB- 231(0 day)

A.expression of α-SMA in co-MSCs after co-culture; B.expression of tenascin-c in co-MSCs after co-culture;*P<0.05,**P<0.01 compared with untreated MSCs(0 day)

图2RT-qPCR检测共培养后MSCs中α-SMA、tenascin-c的mRNA表达

*P<0.05, **P<0.01 compared with untreated MSCs(0 day)图3 Western blot检测MDA-MB- 231与MSCs共培养0、3、6及9 d的α-SMA和FAPA蛋白表达Fig 3 Expression of α-SMA, FAPA in MDA-MB- 231 co-cultured with MSCs by Western

2.3 共培养中抑制乳腺癌细胞系miR- 210可以抑制共培养中MSCs向CAFs转化

转miR- 210-3p抑制剂及对照miR- NC后的乳腺癌MDA-MB- 231细胞(实验分组为：MDA-MB- 231-miR- NC组和MDA-MB- 231-miR- 210-inhibitor组)，再与同比例hAD-MSCs共培养，检测CAFs相关特征标志物的α-SMA、tenascin-c基因表达的改变(P<0.05)。与 MDA-MB- 231-miR- NC组相比，不同时间点(3、6及9 d)检测 MDA-MB- 231-miR- 210-inhibitor组的α-SMA和tenascin-c基因表达水平下调(图4)。

2.4 裸鼠体内成瘤实验

与对照组MCF- 7-miR- NC相比， MCF- 7-miR- 210-inhibitor组肿瘤组织的体积和质量较小(图5)；免疫组化检测显示MCF- 7-miR- 210-inhibitor组CAFs相关的α-SMA和FAPA较MCF- 7-miR- NC组显著下调(图6)；MCF- 7-miR- 210-inhibitor组中α-SMA、FAPA的基因表达较对照组MCF- 7-miR- NC也显著下调(图7)。从肿瘤组织分离的细胞中α-SMA、FAPA和vimentin的蛋白表达和基因结果一致。

3 讨论

MSCs具有自我更新和多向分化潜能,可向肿瘤局部迁移[5],受肿瘤微环境影响向 CAFs转化。CAFs作为肿瘤微环境中的重要细胞成分，不仅仅是被动的为肿瘤生长提供所需的营养物质，更积极主动参与诱导上皮细胞发生恶性转化，促进肿瘤的侵袭和转移[6]。CAFs 通过与周围细胞相互作用和分泌各种促癌因子(包括细胞因子、趋化因子和多种炎性介质)促进肿瘤生长[7- 8]。

在正常和缺氧条件下研究miR- 210对癌细胞系中线粒体功能的影响， 发现miR- 210降低线粒体功能并上调糖酵解，从而使癌细胞对糖酵解抑制剂更敏感[9]。在缺氧状态下，miR- 210是导致ISCU1/2和COX10基因下调的主要原因。miR- 210作为肿瘤缺氧反应变化最敏锐的指标，与许多肿瘤的不良预后直接相关[10]。

A.expression of tenascin-c in MSCs co-culture with inhibition of BCCs miR- 210; B.expression of α-SMA in MSCs co-culture with inhibition of BCCs miR- 210;*P<0.05，**P<0.01 compared with MDA-MB-231-miR-NC group(3 days)

图4RT-qPCR检测BCCs转miR-210抑制剂后CAFs的表达

A.tumor volume of MCF- 7-miR- NC group and MCF- 7-miR- 210-inhibitor group; B.average quality of MCF- 7-miR- NC group and MCF- 7-miR- 210-inhibitor group；*P<0.05; compared with MCF- 7-miR- NC group

图5抑制乳腺癌MCF-7细胞miR-210的表达后降低肿瘤生长

A.α-SMA mRNA expression in tumor tissues; B.FAPA mRNA expression in tumor tissues;*P<0.05，**P<0.01 compared with MCF- 7-miR- NC group

图7RT-qPCR和Westernblot检测肿瘤组织中CAF的mRNA和蛋白水平

在体外实验中，已经得出MSCs和BCCs共培养后BCCs中miR- 210的表达持续上调；miR- 210高表达促使MSCs向CAFs转化；miR- 210在共培养体系中起到关键分子的作用，抑制肿瘤中miR- 210表达可抑制肿瘤的生长和肿瘤细胞的增殖。结合体内动物成瘤实验进一步证实miR- 210参与调控肿瘤的生长。在接下来的研究中，将主要围绕共培养前后MSCs以及CAFs多种分泌因子的改变、代谢方式的改变，以及是否通过下调ISCU1/2靶基因的来发挥作用。

综上所述，本研究发现，miR- 210能够参与调控MSCs向CAFs转化，进而促进肿瘤的生长。期待通过进一步的工作充分验证miR- 210作为乳腺癌早期诊断的特异性标记，并将其发展为肿瘤特异性靶向治疗一个有效的新靶点。本研究也有望应用于对乳腺癌患者的临床诊断与预后评判，可能会对乳腺癌的临床治疗提供有价值的帮助。

：

[1] Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2017[J]. CA Cancer J Clin, 2017, 67: 7- 30.

[2] Huelsken J, Hanahan D. A subset of cancer-associated fibroblasts determines therapy resistance[J]. Cell, 2018, 172: 643- 644.

[3] Xu Q, Wang L, Li H,etal. Mesenchymal stem cells play a potential role in regulating the establishment and maintenance of epithelial-mesenchymal transition in MCF7 human breast cancer cells by paracrine and induced autocrine TGF-beta[J]. Int J Oncol, 2012, 41: 959- 968.

[4] Wang Z, Tan Y, Yu W,etal. Small role with big impact: miRNAs as communicators in the cross-talk between cancer-associated fibroblasts and cancer cells[J]. Int J Biol Sci, 2017, 13: 339- 348.

[5] Rudnick JA, Kuperwasser C. Stromal biomarkers in breast cancer development and progression[J]. Clin Exp Metastasis, 2012, 29: 663- 672.

[6] Luo H, Tu G, Liu Z,etal. Cancer-associated fibroblasts: a multifaceted driver of breast cancer progression[J]. Cancer Lett, 2015, 361: 155- 163.

[7] Shiga K, Hara M, Nagasaki T,etal. Cancer-associated fibroblasts: their characteristics and their roles in tumor growth[J]. Cancers (Basel), 2015, 7: 2443- 2458.

[8] Taddei ML, Cavallini L, Comito G,etal. Senescent stroma promotes prostate cancer progression: the role of miR- 210[J]. Mol Oncol, 2014, 8: 1729- 1746.

[9] Chen Z, Li Y, Zhang H,etal. Hypoxia-regulated microRNA- 210 modulates mitochondrial function and decreases ISCU and COX10 expression[J]. Oncogene, 2010, 29: 4362- 4368.

[10] Wu D, Zhuo L, Wang X. Metabolic reprogramming of carcinoma-associated fibroblasts and its impact on meta-bolic heterogeneity of tumors[J]. Semin Cell Dev Biol, 2017, 64: 125- 131.