miR-93在多囊卵巢综合征患者血清中的表达及临床意义

李 英 ，张学军

（1.天津医科大学免疫学系，天津300070；2.天津市中心妇产科医院检验科，天津300100）

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）在育龄期女性中是一种发病率较高的生殖内分泌疾病，在女性无排卵不孕症病因中约占75%，全球约5%～10%的育龄妇女受其影响[1]。其主要特点是卵巢多囊、雄激素过多症、胰岛素抵抗和持续无排卵[2-3]，主要临床表现为月经周期不规律、不孕、多毛和/或痤疮。微小 RNA（microRNA，miRNA）是属于表观遗传学研究领域的一类非编码单链RNA分子，由内源基因编码，长度约为20～24个核苷酸，参与转录后基因表达调控，在细胞增殖、分化、凋亡，和某些特定器官的发育以及人类多种疾病的发生发展过程中发挥着非常重要的作用[4-5]。近年来，越来越多的研究结果显示，PCOS患者的血清以及卵泡液中有miRNA存在[6-8]，并且其表达水平与健康人相比具有显著差异，由此推测miRNA或可作为一种生物标志物，对深入研究PCOS的发病机理和临床诊治都具有非常积极的意义。本研究旨在探讨miR-93在PCOS患者血清中的表达及临床意义，为PCOS的诊治提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2014年12月-2015年12月在天津市中心妇产科医院就诊的符合鹿特丹标准[9]的PCOS患者25例为试验组，年龄23～42岁，平均（30.40±1.32）岁；选择同期孕前体检的卵巢功能正常者25例为对照组，年龄21～41岁，平均（28.52±0.99）岁，并记录所有受试者的身高和体质量。两组年龄无显著性差异（t=1.144，P=0.258）。本研究通过医院伦理委员会的认证并取得所有受试者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 晨起空腹抽肘静脉血3 mL，在37℃水浴箱中放置30 min或在室温条件下放置1 h，然后 4 000 r/min，4℃条件下离心 5 min，将分离出的血清置于-80℃冰箱中保存备用。

1.2.2 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测血清miR-93表达 采用天根生化科技北京有限公司的miRcute miRNA isolation kit，严格按照操作说明书提取血清中的总RNA，利用分光光度计检测其浓度及纯度后依照逆转录过程说明将RNA逆转录为cDNA，以U6为内参，在ABI StepOneTM实时荧光定量PCR仪上进行扩增。miR-93引物序列：正义链5′-GAGCTCTAGATGGGGGCCAGGC-3′,反义链 5′-ACGCGTCCTAAATG TGAATAAGT-3′。U6 引物序列：正义链 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反义链5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反应体系 25μL：TransStart Top Green qPCR Super Mix（2×）12.5 μL，cDNA 模板 2 μL，引物各 1 μL，Passive Reference Dye 0.5 μL，DEPC 水 8 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；95℃变性15 s，55℃退火 30 s，70℃延伸30 s，共40个循环。逆转录和荧光定量PCR试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，引物由TaKaRa生物工程有限公司合成。采用2-△△CT法分析miR-93相对表达量，每个样本PCR反应均设置3个复孔并独立重复实验2次。

1.2.3 FBG、TT和HOMA-IR的检测 利用贝克曼库尔特Synchron LX 20生化分析仪测定FBG，并利用化学发光法检测TT和胰岛素水平（INS），具体操作步骤严格按照仪器和试剂盒说明书进行。HOMAIR=FBG×INS/22.5。BMI=体质量（kg）/身高（m2）。

1.3 统计学方法 使用SPSS 22.0软件对实验数据进行统计学处理。符合正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用t检验；非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用秩和检验；相关性分析采用双变量Spearman秩相关检验。绘制受试者工作特征（ROC）曲线用于评价血清miR-93在PCOS中的诊断价值。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCOS 患者与对照组血清 miR-93、BMI、FBG、TT和HOMA-IR的比较 PCOS患者血清miR-93表达水平为2.70（2.10，3.15），显著高于对照组1.01（0.55，1.40），差异有统计学意义（P＜0.01）；PCOS患者BMI、FBG、TT和HOMA-IR均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 两组血清miR-93、BMI、FBG、TT和HOMA-IR的比较Tab 1 Comparison of serum miR-93,BMI,FBG,TT and HOMA-IR between two groups

2.2 两组患者血清中miR-93的表达水平与TT、HOMA-IR的相关性分析 在正常对照组，miR-93的表达水平与TT、HOMA-IR的相关性分析结果显示，r分别为0.03和0.39，P分别为0.95和0.13。在PCOS组，miR-93的表达水平与TT、HOMA-IR的相关性分析结果显示，r分别为0.33和0.28；P分别为0.09和0.47。由此可见，两组患者血清miR-93的表达水平与血清总睾酮、胰岛素抵抗指数不具有相关性。

2.3 血清miR-93用于诊断PCOS的ROC曲线分析 ROC曲线分析结果显示血清miR-93对PCOS可能具有潜在的诊断价值，曲线下面积（AUC）为0.73，敏感度为70%，特异度为78%，正确诊断指数为 55%，95%置信区间（CI）为[0.59-0.87]。见图 1。

图1 血清miR-93诊断PCOS的ROC曲线Fig 1 ROC curve of serum miR-93 for diagnosis of PCOS

3 讨论

PCOS可导致女性不孕，还会诱发2型糖尿病、肥胖以及心脑血管疾病等多种代谢性疾病。本研究首先分析了PCOS患者与对照组的一些基本情况，结果表明PCOS患者的BMI、FBG、TT和HOMA-IR均明显高于卵巢功能正常者，差异具有统计学意义。PCOS患者表现为肥胖、高雄激素血症和胰岛素抵抗。已有研究报道，针对肥胖、胰岛素抵抗和高雄激素血症的治疗措施，对于改善大多数PCOS患者的临床症状和体征亦均有效[10]。

miRNA具有组织特异性，主要通过与靶基因mRNA3′端非编码区域 （3′-untranslated region,3′UTR）互补配对，对靶基因mRNA进行切割或翻译抑制[11]。研究表明，miRNA具有抗核酸酶活性和容易获取等优势[12]，且在血清中丰富、稳定表达，因此血清miRNA可能被用作某些疾病潜在的、简便无创的诊断指标。Sorensen等[13]研究结果表明，与正常人相比，miRNA在PCOS患者卵泡液中的表达水平有显著差异，由此推测异常的miRNA表达可能与PCOS的发病机制有关。Song等[14]研究结果显示，与健康对照者相比，miR-592在PCOS患者血清中的表达水平显著下调；过表达miR-592可通过负调控LHCGR的表达发挥抑制人卵巢颗粒细胞的活力并阻滞细胞从G1期转化为S期的作用。

本研究显示，PCOS患者血清中miR-93的表达量明显高于正常对照组，与miR-93在PCOS患者脂肪组织中的表达趋势相似[15]，提示其与PCOS的发病可能有一定的关联。值得注意的是，本研究利用两变量相关性分析方法对miR-93的表达水平与血清总睾酮水平、胰岛素抵抗指数之间的相关性进行了分析，实验结果显示，两组患者血清中miR-93的表达水平与睾酮、胰岛素抵抗指数均无明显相关。由此可见，PCOS患者血清miR-93表达水平的增高是不依赖于患者胰岛素水平、胰岛素抵抗、高雄激素血症等因素的。

在诊断医学研究中，ROC曲线不仅可显示出诊断方法的敏感度及特异度之间的相互关系，并且可用于评价疾病诊断方法的准确性。本研究利用ROC曲线分析显示miR-93诊断PCOS的灵敏度和特异度分别为70%和78%，具有一定的诊断价值。Sathyapalan等[16]研究发现，miR-93和 miR-223在PCOS患者血清中表达水平显著高于卵巢功能正常对照者，且miR-93诊断PCOS的敏感性和特异性均高于miR-223，即miR-93的诊断价值优于miR-223；使用多元逻辑回归分析发现，联合miR-93和miR-223诊断PCOS的敏感性和特异性无明显增高。也有学者报道虽然作为一个单一的诊断指标，其灵敏度和特异性都稍低，然而miR-93可能是一个用于支持PCOS阳性诊断而不是作为一种排除PCOS诊断的生物标志物，这对于诊断困难的青春期或在围绝经期的更年期女性是有帮助的[17]。

综上所述，miR-93可能作为一种生物标志物，为PCOS的诊治提供新靶点。然而，miR-93在PCOS中所发挥的具体作用以及作用机制仍不清楚，有待进一步深入研究。

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