应用液体蛋白芯片-飞行时间质谱技术诊断乳腺癌的临床价值

杨帆，陈英剑，亓敏，胡成进

（1. 青岛市海慈医疗集团医学检验科，山东青岛 266033； 2. 济南军区总医院实验诊断科，济南 250000 ）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，也是引起女性死亡的重要病因。全球癌症2012年统计报告显示，乳腺癌新发病例占女性恶性肿瘤新发病总数的25.0%，占恶性肿瘤死亡总数的15.0%［1］。液体芯片-飞行时间质谱-ClinProt系统是基于质谱技术开发的蛋白质组学半定量分析系统［2］。目前，ClinProt系统已广泛应用于不同肿瘤的研究，如宫颈上皮内瘤变趋势预测，食管鳞状细胞癌和健康对照的质谱表达谱图的建立等［3-4］。本研究应用液体芯片-基质辅助激光解析串联飞行时间质谱（matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS-ClinProt）系统对乳腺癌患者和健康对照血清蛋白肽谱进行采集分析，根据差异蛋白建立乳腺癌诊断模型，评估该模型对于乳腺癌早期诊断的临床价值，同时寻觅具有乳腺癌表达特异性的血清蛋白质/多肽。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病历资料：收集2015年1月至2016年7月济南军区总医院甲状腺乳腺外科收治的140例乳腺癌女性患者的血清标本作为病例组，年龄29～68岁，平均（43.23±11.89） 岁，所有病例均经术后病理学金标准确诊，术前均未进行临床治疗；收集济南军区总医院病例组同期60例健康体检女性的血清标本作为健康对照组，年龄24～62岁，平均 （41.53±14.34）岁，既往无乳腺癌及相关疾病，体检未见其他恶性疾病。2组标本均来自女性，且年龄差异无统计学意义 （P＞0.05） ，将研究对象随机分层抽样分为建模组 （乳腺癌患者120例和健康女性40例） 和验证组（乳腺癌患者20例和健康女性20例） ，见表1。

表1 病例组和健康对照组临床资料比较Tab.1 Comparison of clinical data between the breast cancer and healthy control groups

1.1.2 标本采集和预处理：用含有分离胶的采血管采集空腹静脉全血5 mL，室温静置30 min后离心，收集血清，将血清按照200 μL/EP管分装置于-80 ℃冰箱保存，避免反复冻融。

1.1.3 试剂与仪器：MALDI-TOF-MS仪及原装进口配套的试剂和定标品 （autoflex speedTMTOF/TOF，德国BRUKER公司） ；弱阳离子交换磁珠分析试剂盒（MB-WCX） 和标准蛋白/多肽 （德国BRUKER公司） ；三氟乙酸、乙腈、丙酮 （美国Sigma-Aldrich公司） ；全自动电化学发光分析检测仪 （combs 6001，瑞士罗氏公司） 。

1.2 方法

1.2.1 标准品校准：利用MALDI-TOF-MS采集标准品内已知分子量化合物的质谱图，反复叠加5次以上，同时确保已校准成分的分辨率达到ClinProt系统要求的标准。

1.2.2 重复性检测：利用弱阳离子交换磁珠吸附10例样本 （5例乳腺癌血清、5例健康女性血清） 的低丰度蛋白/多肽，经MALDI-TOF-MS和ClinProt Tools v3.0软件分析后，比较反复测定质谱图和平均变异系数（coefficient of variation，CV） ，观察磁珠对高丰度蛋白去除能力及对目标低丰度蛋白的提取效果和谱图质量，从而判断该方法的重复性。

1.2.3 MB-WCX吸附血清低丰度蛋白：采用表面积大、吸附能力强的弱阳离子交换磁珠吸附血清标本中的低丰度蛋白质/多肽。 （1） 磁珠吸附样本，取10 μL弱阳离子磁珠和同体积的结合缓冲液混匀，加入5 μL 待测血清，再次混匀；室温静置5 min后，利用磁性分离器分离磁珠与上清，弃去上清； （2） 洗涤磁珠，加入100 μL 洗涤缓冲液，在磁性分离器相邻位置反复移动10次直至磁珠与上清彻底分离，弃去上清，重复该洗涤步骤2次； （3） 洗脱磁珠，加入5 μL洗脱缓冲液，反复吹打10次，在磁珠分离器中静置2 min，使磁珠与上清彻底分离，收集分离后的上清液，向样品管中加入5 μL稳定缓冲液，充分混匀后，24 h内利用MALDI-TOF-MS进行分析。

1.2.4 MALDI-TOF-MS采集标本质谱图：稀释1 μL多肽样品溶液于10 μL混合基质溶液中，反复颠倒5次以上，直至充分混合；加1 μL混合溶液点靶，室温风干后激光电离 （激光频率60 Hz） ，采集每一个纳入血清的蛋白肽表达谱图。

1.2.5 生物信息学及数据统计学分析：将MALDITOF-MS采集的所有标本质谱图通过flexAnalysis软件进行标峰，并检查已采集图谱质量。将质谱图信息按照分组调入ClinProt v3.0软件进行校正和统计分析，不同质荷比分子的峰强度为量化指标，获得2组平均质谱图、准胶图、峰统计列表。根据不同质荷比蛋白/多肽峰强度的表达差异情况，选择基因遗传算法 （genetic algorithm，GA）、神经网络算法 （neural network algorithm，SNN） 和快速分类算法 （fast classification algorithm，QC） 分别建立模型，计算其识别率并进行双盲验证，选取诊断效能最强的模型。

1.2.6 血清癌胚抗原 （carcinoembryonic antigen，CEA） 和癌抗原153 （cancer antigen 153，CA153） 的检测：使用罗氏combs 6001全自动电化学发光分析检测仪检测血清中CEA和CA153的含量。CEA和CA153的临界参考值分别为5 ng/mL和25 U/mL。

2 结果

2.1 重复性检测结果

结果显示，5次采集的质谱图基本一致，病例组平均CV为21.5%，对照组为23.5%，2组CV均小于30%，表明该方法重复性良好［4］，可进行后续试验。

2.2 差异蛋白定量分析

图1 病例组 （红色） 与对照组 （绿色） 平均总质谱图Fig.1 Average total mass spectrogram for the tumor group （red） and control group （green）

应用ClinProt v3.0软件对病例组和对照组相对分子量（10～100）×103的蛋白质谱图进行统计分析，得到2组的总平均谱图 （图1） ，根据总平均谱图同一质荷比峰强度及峰面积的不同，发现35个表达明显差异的蛋白质/多肽 （P ＜ 0.01） （信噪比S/N＞5） ，其中7个蛋白质/多肽表达上调，28个表达下调。其中Mass 5 159.73，Mass 1 865.76，Mass 5 749.51，Mass 6 301.27表达差异最显著，可达到P ＜ 0.000 001（表2） 。

表2 ClinProt差异蛋白峰统计参数Tab.2 Statistical parameters of ClinProt differential protein peaks

2.3 建立乳腺癌诊断模型

不同分析方法建立诊断模型的诊断效能均不同，GA、SNN和QC对乳腺癌的的识别准确率分别为95.0%、90.0%、90.8%。选择最优的GA以4个差异蛋白质 （Mass 1 569、3 934、5 750、7 765） 建立乳腺癌诊断模型，建立模型的4个蛋白质曲线下面积依次为0.75、0.76、0.83、0.86 （图2） 。双盲验证结果显示其对乳腺癌识别率为85%。诊断乳腺癌的灵敏度为95.0%，特异度为92.5%，Youden 指数为0.875。

2.4 诊断模型与CEA、CA153联合诊断比较

图2 差异蛋白诊断乳腺癌的受试者工作特征曲线图Fig.2 The ROC curve of differential protein in the diagnosis of breast cancer

将建立成功的诊断模型与纳入样本CEA、CA153的联合诊断结果进行比较，结果显示，该模型对乳腺癌的诊断灵敏度、准确率以及Youden指数均优于现临床血清标志物CEA、CA153联合诊断 （表3） ，其中灵敏度最为显著，证明该诊断模型对乳腺癌的早期筛查具有更高的效能。

表3 诊断模型与乳腺癌常用血清学标志物评价指标的比较（%）Tab.3 Comparison between the parameters for the diagnostic model and common breast cancer markers（%）

3 讨论

乳腺癌患者早期无典型临床症状和体征，缺乏高灵敏度特异性的肿瘤标志物，因此对高危人群常常无法进行高效筛查和早期诊断，导致中后期就诊，生存率降低［5-6］。目前国内乳腺癌诊断主要以影像学检查和病理金标准为依据，但两者费用较高，且病理采样对患者身体存在危害。相比之下，肿瘤的血清学检测则具有操作简便、费用低的优点，可用于疾病筛查、早期诊断、复发及预后监测等。目前，CEA和CA153等已作为乳腺癌血清标志物开始应用于临床乳腺癌患者的辅助诊断和预后判断，但多项研究表明两者灵敏度以及早期筛查准确率都不够理想［7-8］。因此，寻找乳腺癌新型标志物的问题亟待解决。

乳腺癌的发生发展是受多因素影响的多通路级联反应，过程复杂且伴随着体内多种蛋白的变化。利用液体蛋白芯片-飞行时间质谱技术能够做到对临床血清标本蛋白肽进行快速直接的检测，去除血清中的高丰度蛋白，对低丰度表达蛋白进行高通量分析，筛选高灵敏度特异性的生物标志物，并根据血清差异蛋白肽信息建立诊断模型，可以为乳腺癌早期诊断提供新的思路。

本研究应用液体蛋白芯片-飞行时间质谱技术分析了120例乳腺癌患者和40例健康女性的血清蛋白质谱，发现乳腺癌患者和健康女性血清中蛋白成分差异较大，多种蛋白质/多肽显示出了肿瘤特异性，经后续鉴定认为极有可能成为乳腺癌新型生物标志物。根据比较结果选择诊断效能最佳的GA建立乳腺癌诊断模型，结果证实该模型诊断识别率较高，能够有效区分乳腺癌和健康女性标本，且诊断灵敏度、准确率和Youden指数均高于CEA和CA153的单独或联合诊断效能。

本研究在前期研究的基础上，扩大样本量对应用液体蛋白芯片-飞行时间质谱技术建立的乳腺癌诊断模型进行了进一步的研究。证明利用该方法建立的乳腺癌诊断模型有潜力成为切实可行并值得临床广泛推广的新型诊断方法。但本研究同时发现2次研究中得到的差异蛋白表达情况存在波动，未能达到一致，怀疑可能与患者病情发展程度有关，需要通过进一步研究找到差异源头，对明显差异蛋白在乳腺癌发生发展中的生物学作用进行进一步探讨。

［1］ TORRE LA，BRAY F，SIEGEL RL，et al. Global cancer statistics，2012 ［J］. CA Cancer J Clin，2015，65 （2） ：87-108. DOI：10.3322/caac.21262.

［2］ LEUNG SM，PITTS RL. A novel approach using MALDI-TOF/TOF mass spectrometry and prestructured sample supports （AnchorChip Technology） for proteomic profiling and protein identification ［J］.Methods Mol Biol，2008，441：57-70. DOI：10.1007/978-1-60327-047-2_4.

［3］ LIU Y，WEI F，WANG F，et al. Serum peptidome profiling analysis for the identification of potential biomarkers in cervical intraepithelial neoplasia patients ［J］. Biochem Biophys Res Commun. 2015，465 （3） ：476-480. DOI：10.1016/j.bbrc.2015.08.042.

［4］ JIA K，LI W，WANG F，et al. Novel circulating peptide biomarkers for esophageal squamous cell carcinoma revealed by a magnetic beadbased MALDI-TOFMS assay ［J］. Oncotarget，2016，7 （17） ：23569-23580. DOI：10.18632/oncotarget.8123.

［5］ BULUT A，BULUT A. Knowledge，attitudes and behaviors of primary health care nurses and midwives in breast cancer early diagnosis applications ［J］. Breast Cancer （Dove Med Press） ，2017，9：163-169.DOI：10.2147/BCTT.S126124.

［6］ 唐金海，姚宇锋. 早期乳腺癌的诊断和外科治疗进展［J］. 中国普外基础与临床杂志，2011，18 （9） ：916.

［7］ 赵晶，刘红，张爱敏，等. 乳腺癌患者血清可溶性肿瘤标志物的临床价值研究［J］. 中国肿瘤临床，2008，35 （24） ：1411-1414. DOI：10.3969/j.issn.1000-8179.2008.24.010.

［8］ 叶强，陈峻. 多种肿瘤标志物在检验乳腺癌的临床应用［J］. 肿瘤基础与临床，2009，22 （4） ：350-351. DOI：10.3969/j.issn.1673-5412.2009.04.028.

［9］ 杨帆，陈英剑，胡成进. 基于质谱技术应用CLINPROT系统建立乳腺癌诊断模型［J］. 国际检验医学杂志，2016，37 （24） ：3388-3390.DOI：10.3969/j.issn.1637-4130.2016.24.002.