胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1表达对鼻咽癌细胞系CNE1发生发展的研究

郑富春,祁晓倩

(陕西省安康市人民医院：1.耳鼻咽喉科；2.检验科 725000)

鼻咽癌是耳鼻咽喉科较为常见的癌症之一，发病因素可能与当地湿热的环境气候及饮食偏辛辣有关[1]。鼻咽癌病死率较高，目前临床多采用放射治疗，原发性鼻咽癌在提高患者生存率等方面取得了显著成效，但手术时间较长，预后不佳且易造成患者面容改变[2]。通过抑制胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(IGFBP-rP1)的表达对鼻咽癌细胞系CNE1细胞的增殖、侵袭、迁移能力的影响，检测CNE1细胞半衰期变化情况和相关蛋白变异后性质的表达[3]。现探讨在此蛋白基础上构建2条特异性针对IGFBP-rP1基因的小干扰RNA(siRNA32、siRNA34)，并采用各种临床检测技术对IGFBP-rP1基因和CNE1细胞的相关指标进行检测,分析抑制IGFBP-rP1基因的表达能有效治疗鼻咽癌且术后患者不易发生并发症。报道如下。

1 材料与方法

1.1一般材料 本研究所用CNE1细胞购买自中南大学高等研究中心细胞实验室，转染质粒购买自上海吉玛公司。

1.2仪器与试剂 (1)材料：鼻咽癌细胞系CNE1细胞，空白载体，2条特异性针对IGFBP-rP1基因的小干扰RNA(siRNA32、siRNA34)，转录酶和逆转录酶。(2)试剂：Trizol试剂，秋水仙素，龙胆紫溶液，无酶RNA冲洗液，SYBR Green 1染料，上游引物，下游引物，dNTP。(3)RT-PCR、Western blot检测试剂：30 g丙烯酰胺和0.8 g N,N′-亚甲丙烯酰胺、4×Tris·Cl/SDS,pH 8.8、4×SDS电泳缓冲液，TEMED (N,N,N′，N′-四甲基乙二胺),10%过硫酸铵。(4)四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测试剂：MTT 0.5 g，100 mL磷酸盐缓冲液(PBS)或无酚红培养基。(5)肿瘤细胞重组基底膜侵袭实验试剂：无血清DMEM，1%胎牛血清DMEM,1640完全培养基(也可加到20%血清)，无菌PBS，胰酶，4%多聚甲醛固定液或甲醇，结晶紫染液[0.1%(g/mL)PBS结晶紫]。(6)细胞运动实验：等渗盐水,细胞运动导板。(7)流式细胞仪技术实验试剂：秋水仙素。

1.3siRNA设计与构建 将IGFBP-rP1基因的DNA双螺旋结构通过解螺旋酶进行催化裂解打开成单链后，对其中之一的单链进行逆转录获得RNA，将此RNA进行PCR扩增后得到多条单链RNA，向这些多条RNA中加入rRNA进行蛋白质翻译后，再利用mRNA进行核糖体加成，然后形成siRNA[4]。

1.4细胞培养及转染 将CNE1细胞置入琼脂培养基中放入细胞保温箱进行传代培养，将培养后的细胞随机分为4组即阴性对照组、空白组、siRNA32组(siRNA32转染)、siRNA32组(siRNA34转染)。其中空白组不做任何处理；阴性对照siRNA转染；siRNA32组与siRNA32组分别转染siRNA32转染和siRNA34转染。分别采用RT-PCR、Western blot检测各组IGFBP-rP1 mRNA及蛋白的表达水平，使用细胞运动实验检测CNE1细胞的迁移能力，应用肿瘤细胞重组基底膜侵袭实验检测CNE1细胞的侵袭能力、MTT法检测CNE1细胞的增殖能力、流式细胞仪技术检测细胞周期。8～10周期后分别对4组实验结果进行统计，分析数据结果。

1.5检测方法

1.5.1RT-PCR检测方法 4组细胞分别进行RT-PCR法检测，取冻存CNE1细胞，5 000 r/min离心40 min后放入无酶RNA，应用无酶RNA对各组细胞进行加速繁殖后，只去除较多的传代培养的各组细胞进行观察。

1.5.2蛋白免疫印迹法(Western blot)检测方法 4组细胞分别进行Western blot法检测，将培养的CNE1细胞放在2块干净的玻璃平板之间离心后备用，配制好的甲基丙烯酸酯分离胶液体并脱气，然后放入13%的过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌，混匀。按所需分离的蛋白质分子大小选择合适的甲基丙烯百分比浓度，以上2种材料进行充分混合后将分离的CNE1细胞与混合液一起37 ℃温水中孵育40 min，充分清洗，再将硝酸纤维素膜与CNE1细胞混合显色。

1.5.3细胞运动实验 4组细胞分别进行细胞运动实验，取冻存CNE1细胞，12 000 r/min离心30 min后应用等渗盐水制作等渗液细胞运动导板，CNE1细胞悬液滴在导板的同一高度，观察各组细胞的运动情况[5]。

1.5.4肿瘤细胞重组基底膜侵袭实验 4组细胞分别进行肿瘤细胞重组基底膜侵袭实验，取冻存CNE1细胞10 000 r/min离心40 min，应用基质胶铺板制备CNE1细胞悬液，检测各组细胞侵袭情况[6]。

1.5.5MTT法 4组细胞分别进行MTT法检测，取冻存CNE1细胞15 000 r/min离心40 min，每0.2 mL Trizol试剂裂解样本中加入0.15 mL氯仿进行裂解操作，26 ℃水浴加热采用无酶RNA冲洗液进行洗涤，再次15 000 r/min离心10 min，获得RNA，将此RNA进行逆转录后培养，检测各组细胞增殖情况[7]。

1.5.6流式细胞仪技术 4组细胞分别进行流式细胞仪技术实验，取冻存CNE1细胞5 000 r/min离心45 min，向各组细胞中加入秋水仙素溶液，使细胞增殖的速度减缓从而使细胞固定在特定的细胞周期上，检测各组细胞的细胞周期。

2 结 果

2.1各组细胞IGFBP-rP1 mRNA及蛋白表达水平结果比较 阴性对照组和空白组IGFBP-rP1 mRNA及蛋白表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；siRNA32组和siRNA34组IGFBP-rP1 mRNA及蛋白表达水平显著低于阴性对照组和空白组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1和图1。

表1 各组IGFBP-rP1 mRNA及蛋白表达水平结果比较

注：与空白组比较，aP<0.05；与阴性对照组比较，bP<0.05

注：1表示空白组；2表示阴性对照组；3表示siRNA34组；4表示siRNA32组

图1 Western blot法检测各组IGFBP-rP1蛋白表达水平

2.2各组细胞CNE1细胞迁移能力结果比较 阴性对照组和空白组CNE1细胞迁移数目比较，差异无统计学意义(P>0.05)；siRNA32组和siRNA34组CNE1细胞迁移数目显著低于阴性对照组和空白组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组细胞CNE1细胞迁移能力结果比较

注：与空白组比较，aP<0.05；与阴性对照组比较，bP<0.05

2.3各组细胞CNE1细胞侵袭能力结果比较 阴性对照组和空白组穿过PVP-F膜的CNE1细胞数目比较，差异无统计学意义(P>0.05)；siRNA32组和siRNA34组穿过PVP-F膜的CNE1细胞数目显著低于阴性对照组和空白组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组细胞CNE1细胞侵袭能力结果比较

注：与空白组比较，aP<0.05；与阴性对照组比较，bP<0.05

2.4各组细胞CNE1细胞增殖能力结果比较 培养24、48 h后，阴性对照组和空白组CNE1细胞增殖OD值比较，差异无统计学意义(P>0.05)；siRNA32组和siRNA34组CNE1细胞增殖OD值显著低于阴性对照组和空白组(P<0.05)。见表4。

表4 各组细胞CNE1细胞增殖能力OD值结果比较

注：与空白组比较，aP<0.05；与阴性对照组比较，bP<0.05

2.5各组细胞CNE1细胞增殖周期结果比较 培养48 h后，siRNA32组和siRNA34组G0/G1期、G2/M期细胞所占比例显著高于阴性对照组和空白组(P<0.05)；siRNA32组和siRNA34组S期细胞所占比例显著低于阴性对照组和空白组(P<0.05)。见表5。

表5 各组细胞CNE1细胞增殖周期结果比较

注：与空白组比较，aP<0.05；与阴性对照组比较，bP<0.05

3 讨 论

鼻咽癌病理病因目前认为与3种因素有关，即遗传因素、病毒因素(主要为EB病毒感染)、环境因素，临床对鼻咽癌的治疗方法很多，但治疗效果都不确切，现抑制鼻咽癌相关基因的表达对鼻咽癌进行靶向治疗[8]。

IGFBP-rP1是一种近年来被发现的胰岛素样生长因子泛素偶联蛋白，该蛋白翻译携带的鼻咽癌基因的独特高表达性与鼻咽癌的发生、发展密切关相[9]。IGFBP-rP1通过CNE1细胞上皮间充质胚胎转化后在鼻咽癌疾病进程中起癌基因作用，IGFBP-rP1能通过促鼻咽癌原癌基因表达而促进鼻咽癌细胞的增殖、转移、侵袭[10-11]。本研究结果证实，IGFBP-rP1对鼻咽癌细胞的干细胞特性具有调控作用，且证明IGFBP-rP1能经特异性siRNA载体而调控鼻咽癌相关基因的表达，实现其增强鼻咽癌干细胞特性的作用。本研究结果显示，可以通过抑制IGFBP-rP1表达而抑制鼻咽癌CNE1细胞的增殖、侵袭、转移。IGFBP-rP1培养数天后细胞迁移能力较强，说明IGFBP-rP1表达后有较多CNE1细胞进行迁移，提示鼻咽癌在该基因的调控下可发生较快迁移至其他组织器官，甚至会累及到较多的淋巴细胞。

CNE1细胞RNA中的琥珀酸还原酶，能使外源性MTT氧化还原为不溶性的甲瓒并沉积细胞，但死细胞无此功能[12]。当细胞增殖时并不影响甲瓒在CNE1细胞中的数量，会随着细胞增殖而分裂增多，伴随细胞质中不断裂解为更小的粒子，当CNE1细胞增殖趋向最大化完成时，二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在700 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活CNE1细胞增殖的数量[13-15]。本研究结果显示，IGFBP-rP1相对表达量均值较低，说明表达基因产物与鼻咽癌的特异性较高。而IGFBP-rP1增殖较多CNE1细胞，说明该蛋白表达后鼻咽癌相关细胞会出现高增殖效率。不同细胞周期进行抑制IGFBP-rP1时所产增殖的细胞数量、迁移、侵袭性不同，表明在特定时期对该蛋白进行抑制能有效治疗鼻咽癌。

本研究创新性在于通过抑制IGFBP-rP1基因表达对鼻咽癌系细胞进行靶向定位治疗，可避免临床其他手术治疗的不确定性。该手术利用基因抑制法可增强患者预后，鼻咽癌系细胞增殖率、转移率、侵袭周围其他组织的概率极大地降低，值得临床其他难治性手术的借鉴。

综上所述，探讨抑制IGFBP-rP1可有效抑制鼻咽癌细胞系CNE1细胞的增殖、侵袭、迁移能力，安全可靠，值得临床推广使用。

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